概要

ヒト血液試料中の循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cell：CTC）の濃縮、計数、および各種解析を行う受託サービスです。がん転移（上皮間葉転換：EMT）の研究や、がんの検出・治療法の開発に有用です。

サービスパッケージ一覧

作業内容	Package 1	Package 2	Package 3.1	Package 3.2
CTCの濃縮・計数	○	○	○	○
バイオマーカータンパク質の検出	－	○	－	－
mutaFISH解析	－	－	○	－
CTCの単離、WGA（全ゲノム増幅）、 DNAシークエンシング	－	－	－	○

• CTCの濃縮・計数
  CytoQuestシステム（CytoQuest CR、専用ナノアレイチップCytoChipNano、細胞捕捉・検出用抗体セット）を用いて、ご提供いただいた全血試料中に含まれる目的細胞を濃縮・計数いたします。
  細胞捕捉の際に、多くの場合、抗CSV（Cell-Surface Vimentin）モノクローナル抗体（クローン84-1）を用います。本抗体は、CTC、がん幹細胞（Circulating Cancer Stem Cell）、上皮間葉転換（EMT）を起こした細胞を含む各種腫瘍細胞に特異的に結合します。 ＊ CytoQuestシステムの詳細については、こちらをご覧下さい。
• バイオマーカータンパク質の検出
  各種バイオマーカータンパク質に対する抗体を用いて、蛍光免疫染色を行います。
• mutaFISH
  mutaFISH（mutation-specific Fluorescence in situ Hybridization）は、padlock probeとin situでのRCA（Rolling Cycle Amplification）法の組み合わせにより、組織・細胞試料中のDNA・RNAの変異検出を行う手法です。DNAおよびRNAの1塩基変異をシングルセル、1分子レベルで検出でき、点変異やSNPの検出に有用です。
  ＊ mutaFISHの詳細については、こちらをご覧下さい。
• WGAおよびDNAシークエンシング
  単離したCTC中のDNAをWGA（全ゲノム増幅）した後、サンガー法によりDNAシークエンシングを行います。

サービスの流れ（fig.1）

試料前処理：ご送付いただいた全血試料の密度勾配遠心分離による分画
CTCの濃縮：抗細胞表面マーカー抗体を用いた細胞捕捉
CTCの計数：抗マーカー抗体を用いた蛍光免疫染色
CTCの単離：マイクロマニピュレーターを用いた細胞単離（package 3.2）

解析例

膵臓がん患者由来試料からのEMTを起した細胞とがん幹細胞の検出（蛍光免疫染色）

試料：7.5 mLの膵臓がん患者由来の肝門静脈血
用いた抗体：下表のとおり。いずれも対比染色として核をDAPI染色した。
（fig.2）中、白矢印で示されていない細胞は白血球

画像	結果	捕捉用抗体	蛍光免疫染色で用いた抗体
上段	EMTを起したCTCを1細胞検出した（fig.2中の白矢印）。 （PanCK＋，PLS3＋，CD45－，DAPI＋）	抗EpCAM抗体 （ビオチン標識）	抗PanCK抗体 （FITC標識）	抗PLS3抗体 （Alexa Fluor647標識）	抗CD45抗体 （PE標識）
中段	EMTを起したCTCを1細胞検出した（fig.2中の白矢印）。 （CSV＋，EpCAM－，CD45－，DAPI＋）	抗EpCAM抗体 （ビオチン標識）	抗CSV抗体 （FITC標識）	抗EpCAM抗体 （APC標識）	抗CD45抗体 （PE標識）
下段	EMTを起したCTCおよびがん幹細胞を13細胞検出した（fig.2中の白矢印）。 （CSV＋，CD133＋，CD45－，DAPI＋）	抗CSV抗体 （ビオチン標識）	抗CSV抗体 （FITC標識）	抗CD133抗体 （Alexa Fluor647標識）	抗CD45抗体 （PE標識）

非小細胞肺がん（NSCLC）患者由来のCTCの解析（mutaFISH）

橙色：EGFR L858R点変異（Cy3標識）、紫色：EGFR Ex19wt（Texas Red標識）、緑色：抗CSV抗体（FITC標識）でCTCの蛍光免疫染色（fig.3）

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納品されるレポート

• CTC濃縮に用いた抗体パネルの情報
• 抗マーカー抗体を用いた蛍光免疫染色により計数したCTCの数
• 単離したCTCの数
• ご依頼いただいた解析（バイオマーカータンパク質・遺伝子レベル）により得られた情報

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ご提供試料

• BDバキュティナ EDTA 2K入り採血管7mLサイズ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社　カタログ番号：365900） に、室温にて採血したヒト全血（約6mL）
• 採血管を破損しないように梱包し、Abnova社に採血日の翌日午前中に到着するようにご送付下さい。

＊ 採血から測定までの時間が延びることを防ぐために、可能であれば、ご発送される日の午後に採血して下さい。
＊ ご送付時の温度は約22°C を維持して下さい。
＊ 14時以降に到着した試料の分析は翌日になりますのでご注意下さい。
＊ 試料ご発送の際は紛失を避けるために、事前に配送日、配送業者名、到着予定日時をお知らせ下さい。
＊ ヒト由来試料は提供者のインフォームド・コンセントが得られていることが前提となります。提供者の個人情報が特定できないように試料名を匿名化して下さい。