概要

サービスの種類は、レポーターを調節領域の下流に組み込む、特定遺伝子に点突然変異を誘発する、BACの特定領域をプラスミドに移す、薬剤耐性選択マーカーや可視化マーカーを組み込むなど、様々なBAC編集に対応しています。

BAC編集サービスの種類と内容

• BAC編集ストラテジーのデザイン（無料）
  Vector Builder チームのエキスパート研究者が、個々のBAC編集に対して、詳細で効率的なストラテジーを無料で提供します。
• BACの注文は我々にお任せください
  既にお使いになるBACクローンのID番号をご存知の場合は、そのID番号をご連絡ください。まだ特定のBACが決まっていない場合は、デザインと遺伝子からVectorBuilderが最適なBACを探して、手配/入手します。
  殆どのBACは、CHORIのBACPACリソースセンターから入手可能です。BACPACで扱われていないBACに対しては他サプライヤーから入手する場合があります。
  既にお使いになるBACクローンが研究室にあり、その大腸菌ストック（スタブカルチャー）をVectorBuilderに発送できる場合は、BADクローンの手配は省略できます。
• 1ステップBAC編集
  1ステップ編集は、遺伝子発現をモニターするレポーターをプロモーターの下流に組み込むなどの大きなシークエンス変更（fig.1）や、点突然変異の誘発などの小さな変更（fig.2）に用いられます。（fig.1）で表したような大々的な変更は、lacZやGPFレポーターなど目的遺伝子（Gene of Interest: GOI)のDNAフラグメント、5’側と3’側の両方にFRTシークエンスのついた薬剤選択用カセットの2種類を、ターゲット遺伝子の相同シークエンスで挟み、エンドジナスな領域に対する相同組み換え法を使って、置き換えます。編集されたクローンは薬剤耐性カセットを持つため、薬剤セレクションによって、組み換えクローンの単離が可能です。薬剤耐性カセットは、Flpを介した組み換えで除去することができますが、クローンは1箇所FRTシークエンスを残します。
  
  点突然変異を導入する場合（fig.2）、突然変異部を含んだDNAフラグメント、FRTシークエンスに挟まれた薬剤耐性カセットが、5’側と3’側の相同シークエンス配列に挟まれています。5’側と3’側のシークエンス配列に相当するエンドジェナスの配列間で相同組み換えが起こり、編集領域に置き換えられます。薬剤耐性カセットは、Flpを介した組み換えで除去でき、除去した後には1箇所のFRTシークエンスが残ります。この残されたFRTシークエンスは、組み換えの”傷”とみなしてもよく、なぜなら目的のBACクローンには目的の突然変異が組み変わっているからです。この"傷”FRTシークエンスが、目的遺伝子の機能に影響しないよう、通常、FRTシークエンスは、イントロンやUTRといった機能のない領域にデザインされています。

fig.1 目的遺伝子(gene of interest; GOI)のプロモーター下流に、lacZまたはGFPを導入するワンステップBAC編集の概要

fig.2 目的遺伝子の第１エクソン内に点突然変異を導入し、下流イントロンに1箇所のみ残存FRTシークエンスがあるワンステップBAC編集の概要
• 2ステップBAC編集
  2ステップ編集方法は、BACの中にFRTの傷を残すことなく、ポイントミューテーションなどの小さな編集を起こす際に使われています（fig.3）。2ステップ編集方法は、編集を起こしたい近傍に、FRTの傷を残せる都合のいい場所がない場合などに、ワンステップ方法に比べて好まれて使われる方法です。例えば、編集したい遺伝子が大変大きい単一エクソンから成る遺伝子で、ポイントミューテーションをエクソンの真ん中に起こしたいが、近傍にFRTの傷を残せるイントロンがない場合。2ステップ編集方法を使うべきです。
  2ステップ編集方法では、適切な薬剤耐性カセットをつかってポジティブまたはネガティブのスクリーニングを行います（図fig.3）。初回のリコンビネーションは、ポジティブセレクションを行うためのカセットを、ターゲット領域に相同組み換え法に寄って入れ込みます。次回のリコンビネーションでは目的の変異をもったシークエンスを相同組み換え法で置き換え、ネガティブセレクションを行うカセットに入れ替えます。

fig.3 残存シークエンスなしに、大きなシングルエクソンを持つ遺伝子に、点突然変異を導入する2ステップBAC編集の概要
• BACのバックボーンに薬剤耐性や可視化マーカーを入れる
  ネオマイシン耐性などの薬剤耐性選択マーカーやEGFPなどの可視化マーカーをBACのバックボーンに挿入することができます。ほとんどのBACはloxPサイトをそのバックボーンに含んでいます。このサイトを使って発現させたいマーカーを持つカセットを挿入します。この編集を施されたBACを持つ細胞は、トランスフェクションの成果を可視化マーカーの発現または薬剤耐性によって選別することができます。この方法は得にBACが安定にゲノム中に組み込まれ安定化した細胞系統を確立する際、有効です。
• BACの特定領域をプラスミドに移す
  VectorBuilderでは60kbまでのどのようなゲノム領域もプラスミドに移動させることができます。解析したい領域が隣接するシークエンスの影響なく行うことを可能にします。例えば、仮にBAC中に含まれる１遺伝子の機能を解析するために、完全長のBACクローンを使ってトランスジェニックマウスを確立したとします。同じBAC上にある他の遺伝子の影響で、正しい表現型の解釈ができていない可能性があります。遺伝子をプラスミドに移して単離し、 トランスジェニックマウスと確立することで、このような問題を事前に避けることができます。またBACに比べて、プラスミドの方が扱いやすいというテクニカルな利点もあります。
• 編集したBACの検証
  編集されたBACの領域はシークエンシングで確認します。時々、重複配列をもつ場合など、BACが欠失を起こしている現象が認められます。このような問題を最小に留めるため、VectorBuilderでは編集したBACを再度トランスフォームし、単一クローンを分離し、BACの完全長に対して複数のPCR反応を行うことによって、PCRで検出できるレベルの欠失が起こっていないことを確認します。