概要

モルフォリノアンチセンスオリゴは、従来使用されているS-Oligoなどのアンチセンスの問題点（特異性、安定性、配列決定の難しさなど）を克服した、細胞毒性のない、第三世代のアンチセンスです。
モルフォリノアンチセンスオリゴは、従来のアンチセンスの限界を克服し、培養細胞への容易な導入方法が確立されているため、遺伝学や薬物の標的分子の研究に広く使用されています。更に、発生にかかわる遺伝子の機能解析の最適なツールとしても多くの研究者に用いられています。特に、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、ウニなどの受精卵にモルフォリノオリゴをマイクロインジェクションで導入することにより、標的遺伝子の発現を特異的に阻害でき、その使用例も数多く発表されています。

特長

• アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成しているモルフォリノ化合物（fig.1）は、ヌクレアーゼ耐性であり、また安定なためオートクレーブで滅菌することも可能です。
• モルフォリノオリゴとRNAのTm値は、天然DNAとRNAのTm値より少し高い値を示し、安定した結合を形成します（fig.2）。
• RNAとのアフィニティが強く、標的mRNAの二次構造にかかわらず目的の配列に結合するので、容易に有効な配列設計ができます。
• モルフォリノオリゴは高い水溶性のため、調製が容易です。
• 高い特異性を有します。
• モルフォリノアンチセンスオリゴはタンパク質に対する非特異的な結合がありません。

各アプリケーションのモルフォリノ適用濃度

アプリケーション	モルフォリノ濃度	希釈溶液
培養細胞への導入 ［Endo-Porter（#Endo-P）を使用］	1～10μM	滅菌水
培養細胞への導入 ［Cell Scraper（#CS）を使用］	1～20μM	培地
マイクロインジェクション による胚への導入	1～10μM （胚の体積1μLあたり1mMの濃度で1～10nLインジェクション）	滅菌水またはバッファー
無細胞翻訳系での遺伝子抑制	100～1,000nM	ライセート

標的配列設計

配列設計についての詳細はこちらをご覧下さい。

1. タンパク質の翻訳を阻害する場合
   mRNAの5’キャップ部位から開始コドンの約25塩基下流までの領域を標的配列として、翻訳開始複合体を立体的に阻害します。ほとんどの場合、標的遺伝子に対して1つのモルフォリノオリゴをデザインするだけで非常に高い確率でタンパク質の翻訳阻害効果を示します。（fig.3）
2. mRNAのスプライシングを阻害する場合
   pre-mRNAのエキソンとイントロンの境界領域を標的配列として、スプライシングを阻害しmRNAの成熟を不完全にします。ノーザンブロッティングやRT-PCRといったRNAレベルでの解析により阻害効果を確認できます。特定のスプライシングバリアントに対する発現阻害も可能です。（fig.4）
   
   ＊ ご注文の際には、スプライシング阻害を標的とする旨をお知らせ下さい。

配列設計追加情報

1. タンパク質の翻訳を阻害する場合（fig.5）
   特定のmRNAの翻訳を阻害するためには、モルフォリノオリゴの一部が開始コドンの上流に結合していればよいので、5’-UTR（非翻訳領域）内の標的部位に相補的なモルフォリノオリゴを結合させます。翻訳開始複合体の一部であるリボソームの小サブユニットが5’キャップまたは内部リボソーム侵入部位（IRES）から開始コドンに向かって移動する際に、その経路上に結合したモルフォリノオリゴが小サブユニットの進行を停止し、成熟したリボソームの形成を中断することができます。なお、5’-UTR内にイントロンがある場合は、開始コドンがその後のエクソン内に現れることにご留意下さい。
   
   
   fig.3 標的配列設計：タンパク質の翻訳を阻害する場合

   
   fig.4 標的配列設計：mRNAのスプライシングを阻害する場合
2. mRNAのスプライシングを阻害する場合（fig.6）
   モルフォリノオリゴは、スプライスジャンクションまたはスプライス調節タンパク質の結合部位のいずれかを標的としてスプライシングを改変します。スプライスジャンクションを標的とする場合、25塩基のモルフォリノオリゴは、エクソン配列由来の0～10塩基と、イントロン配列の末端部分を標的とします。最初、または最後のスプライスジャンクションを標的にすると、通常、隣接するイントロンが挿入されます。

他のスプライスジャンクションを標的にすると、通常は隣接するエクソンが欠失されます。また、ダブルエクソンスキッピングや隠れたスプライス部位の活性化などにより、イントロンの一部挿入や、エクソンの一部欠失が引き起こされることもあります。時には、例えばエクソンが丸ごと欠失した転写産物と、エクソンが部分的に欠失した転写産物の2つの産物が生じる場合もあります。（fig.7）

コントロール実験用モルフォリノオリゴ鎖（Control Oligo）

1. 汎用コントロールオリゴ鎖（Standard Control）
   コントロール実験用の25 merのStandard Control Morpholino Oligoです。
   
   5’ - CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT TAT A - 3’
   
   この配列は、ヘモグロビン異常症であるサラセミアにおける赤血球β-グロビンpre-mRNA中705番目の部位のスプライシング異常により生じた配列に由来し、正常細胞では、特異的標的部位や生物学的活性を有していません。
2. カスタムデザインオリゴ鎖（Custom Designed Control）
   
   Invert of Antisense
   カスタム配列のコントロールオリゴ鎖が必要な方は、アンチセンスとは逆配列のオリゴ鎖を使用することをお勧めします。このオリゴ鎖は、アンチセンスオリゴ鎖と同一長、同一塩基組成であるため比較コントロールに適しています。
   
   

   例）アンチセンス配列　　　　　　5’ - AAC GAA CGA ACG AAC GA CGA ACG - 3’
   　　逆配列コントロール　　　　　5’- GCA AGC AAG CAA GCA AGC AAG CAA - 3’

   
   Antisense Containing 5 mis-pairs
   厳密なコントロール実験を行いたい場合には、以下のように5か所にミスマッチ部位の入ったオリゴ鎖を用いることをお勧めします。
   ミスマッチコントロールを用いることにより、アンチセンスオリゴ鎖が実際に厳密な配列特異性を示すことが実証されます。
   
   

   例）アセンチセンス配列　　　　　5’ - AAC GAA CGA ATG AAC GAA CGA ACG - 3’
   　　5mis-pairsコントロール　　　5’ - AAC AAA TGA ACG AAC GAG CGG ACG - 3’

   Sense Complement of Antisense
   下記のようなセンス配列オリゴ鎖の作製もいたしますが、GeneTools社ではモルフォリノアンチセンスのコントロール実験用としては、あまりお勧めしていません。
   
   

   例）アンチセンス配列　　　　　5’ - AAC GAA CGA ACG AAC GAA CGA ACG - 3’
   センス配列コントロール　　　　5’ - CGT TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT - 3’

モルフォリノオリゴ鎖の細胞導入用製品

• Endo-Porter（fig.8）
  両親媒性のペプチドから成るトランスフェクション試薬です。エンドサイトーシスにより、モルフォリノオリゴヌクレオチド（＊1）を始め、ペプチド、タンパク質、抗体などを、細胞の代謝レベルや形態を変化させずに導入できます。
  従来のDMSO溶液製品（Endo-Porter DMSO）、DMSOフリー水溶液製品（Endo - Porter Aqueous）に加え、さらに導入効果が高く細胞毒性も低いPEG溶液製品（Endo-Porter PEG）が発売されました。使用する細胞に合わせて製品を選択できます。
  
  ＊1 低分子量（M.W.：＜8 kDa）かつ負に荷電した物質の場合は、導入効率が低下します。モルフォリノオリゴヌクレオチドを導入する際は、未標識またはリサミン標識のものをご使用下さい。また、Endo-Porterによる細胞への導入には、10μMのモルフォリノオリゴヌクレオチドを使用することをお勧めします。
  † 使用するEndo-Porterの量はロットごとに変動します。製品添付のプロトコルをご覧下さい。

fig.8 Endo-Porterによる導入機構


• Endo-Porterの特長
  ・あらかじめ導入物質とEndo-Porterの複合体を形成させる必要がなく、各々を直接培地に加えだけで導入できます。
  ・付着細胞、浮遊細胞のいずれにも使用できます。
  ・無血清培地、および血清濃度が10％までの培地で導入可能です。
  ・細胞毒性を示さず、細胞の代謝レベルや形態を変化させずに導入できます。
  ・導入する際に特別な培地は不要です。また、導入操作後、Endo-Porterの除去や培地交換も必要ありません。
  ・Endo-Porterが適切な濃度で培地中に存在する限り、目的物質が導入され続けます。