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株式会社薬研社

ID: J01499
ID: J01499
フィルジェン / Arraystar

Epitranscriptomic Array 受託解析サービス

mRNAおよびlncRNA、またはcircRNAにおいて主要なN6-メチルアデノシトシン(m6A)におけるエピクリプトーム修飾の定量化を行うことができます


カテゴリ
遺伝子発現解析 > マイクロアレイ解析 > 遺伝子発現解析・網羅遺伝子解析
遺伝子発現解析 > マイクロアレイ解析 > small RNA・miRNA発現解析
遺伝子発現解析 > マイクロアレイ解析 > メチル化解析

サービスについて

概要

m6A、m1A、m5C、およびシュードウリジンなどのRNA修飾は、エピトランスクリプトーム、および遺伝子発現制御に深く関係しています。特にm6Aは、mRNAおよびlncRNAにおけるもっとも豊富な内部修飾となっており、転写後mRNA/lncRNA代謝、および機能のあらゆる局面に影響を与えます。さらに、m6Aは、キャップに依存しないcircRNAの翻訳開始やPrimary microRNA(pri-miRNA)のプロセシングなど、他の多くのncRNAの機能にも関与しています。
RNAの潜在的な影響は、遺伝子転写物だけでなく、転写物の修飾率にも影響します。しかしながら、現在のトランスクリプトームワイドのRNA修飾プロファイリングにおいては、主に修飾部位のマッピングは扱うものの、その転写物についての修飾RNAの割合を定量化するところまでは至っていませんでした。

特長

本サービスで使用するエピトランスクリプトームマイクロアレイは、2色チャンネルマイクロアレイテクノロジーと、RNA修飾免疫沈降法を組み合わせて、転写産物をアイソフォーム特異的にRNAの修飾レベルの割合を定量化します。このマイクロアレイはmRNA、lncRNA、circRNA、pre-miRNA、pri-miRNA、snoRNA、およびsnRNAの各クラスのエピトランスクリプトームをカバーしています。
エピトランスクリプトームマイクロアレイは、シークエンスによるRNAメチル化解析(MeRIP-Seq)よりも優れた利点を持っています。

  • どの遺伝子転写産物が修飾されているか、条件間の差動的な修飾、各転写産物に対する修飾の割合を単一のマイクロアレイで同時にプロファイルすることが可能です。
  • MeRIP-Seqでプロファイリングが困難なlncRNAやcircRNAであっても、コード、ノンコードのRNAクラスのカバレッジが可能です。
  • rRNAの除去が不要で、MeRIPよりも迅速かつ簡単に解析が行えます。
  • 少量サンプルでの解析が可能で、1μgのtotalRNAから解析が可能です。

【少量サンプルでの解析】
現在のMeRIP-Seq法では、スタートサンプルとして120μg以上のtotalRNAが必要であるため、入手量が限られる希少サンプル等の研究は非常に困難です。このサービスで使用するアレイは、1μgのtotalRNAしか必要としないため、MeRIP-Seqを大幅に下回るスタートサンプルで解析が可能です。

サンプル条件 エピトランスクリプトームマイクロアレイ MeRIP-Seq
スタートサンプル量 ≧3μg total RNA ≧120μg total RNA
mRNAおよびrRNAの除去 不要 必要
インタクトRNA 不要 必要


【マイクロアレイによる各転写産物の修飾率の定量化】
同じRNA転写産物の修飾画分と未修飾画分は、構造やそれらに結合するリードタンパク質のみの違いによって、異なった運命をたどることができます。重要なことに、変化した転写産物の割合は、その後の機能的な結果に非常に大きく関連します(fig.1)。
MeRIP-seq(すなわち m6A-seq)などの現在のRNA修飾プロファイリング法では、修飾部位のマッピングは可能ですが、特定の転写産物の修飾RNAと未修飾RNAの相対的な割合を定量化することはできません。本サービスでは、マイクロアレイ上で2つの蛍光チャネルを使用し、各転写産物の修飾度合を測定することで、修飾された転写産物の割合を決定することが可能です(fig.2)。また、それと同時にどの遺伝子転写物が修飾されているか、異なる条件間の修飾レベルをプロファイリングすることが可能です。

fig.1
変化する修飾化学量論は、同じRNA転写物から機能的多様性を生み出します。修飾RNA(転写産物a)の割合は、ある細胞条件下(例えば細胞状態1)では非常に低くなり得るが、別の細胞条件下(例えば細胞状態2)では高く変化する場合があります。RNAの構造変化や修飾リードタンパク質の直接動作に引き起こすことで、修飾された(転写産物a)は、例えばタンパク質翻訳から、増加したRNAの崩壊まで、異なる運命を獲得します。

fig.2
エピトランスクリプトームマイクロアレイは、Cy5チャンネルで免疫沈降した修飾RNAと、Cy3チャンネルで上清の未修飾RNAをそれぞれ検出し、各転写産物の修飾および未修飾の割合を測定します。これらスプライスされた転写物アイソフォームは、転写物特異的なアレイプローブによって特異的かつ明確に検出します。
【coding および non-coding なエピトランスクリプトームのカバレッジ】
本サービスでは、以下の2種類のマイクロアレイからご選択いただき、解析を行うことが可能です。マイクロアレイのスライド構成等は以下の「マイクロアレイデータベース」をご参照ください。

    Arraystar mRNA&lncRNA Epitranscriptomic Microarray
    mRNA、lncRNA および中サイズの non-coding RNA クラス(pre-miRNA、pri-miRNA、snoRNA、snRNA)をカバー
  1. Arraystar circRNA Epitranscriptomic Microarray
    4サンプル以上かつ2試験以上で観察された発現の信頼性が高い環状RNAをカバー
MeRIP-seq では難しいRNA(lncRNAやcircRNAなど)でも高い感度と精度を発揮します。サンプル中のlncRNA/circRNAジャンクション部位の存在量は非常に低く、シークエンシングによって正確に定量することはできません。IPエンリッチなlncRNA/circRNAジャンクションについても同様です。
lncRNA プロファイリングに対する RNA-seqの制限について
Circular RNA 発現プロファイリングに RNA-seq よりもマイクロアレイを使用する理由について

【転写産物特異的な RNA 修飾レベル】
スプライシングされた転写物アイソフォームは、組織特異的な発現と、異なる生化学的機能を持っています。例えば、TRIM9の長いアイソフォーム(NM_015163)ではなく短いアイソフォーム(NM_052978)は、ウイルス感染に応答して、炎症性サイトカインの生産を選択的に阻害します。このことからも、修飾された転写物アイソフォームの比率の変化が生化学的機能や疾患に関連していることが分かります。
本サービスに使用するマイクロアレイは、特定のエクソンまたはスプライスジャンクションプローブを採用しており、個々の転写物アイソフォームのRNA修飾を正確にプロファイリングし、エピトランスクリプトミクスをより詳細に定義することができます(fig.3)。
Arraystar Epitranscriptpmic Microarray は、転写物特異的なプローブAとプローブBを使用して、TRIM9の長い(NM_015163)および短い(NM_052978)転写物アイソフォームのRNA修飾を明確に検出します。

マイクロアレイデータベース

本サービスは、解析内容に合わせて、mRNA & lncRNA解析用のアレイと、circRNA解析用のアレイの2タイプからご選択いただけます。
                
【mRNA & lncRNA エピトランスクリプトームマイクロアレイ】
プローブ総数 60,613(Human)、60,773(Mouse)、40,991(Rat)
プローブ長 60nt
プローブサイト mRNA & lncRNA:転写物の全長に沿った特異的エクソンまたはスプライスジャンクション配列。
中サイズncRNA:ncRNA内のユニークな配列領域。
プローブ特異性 転写物特異的
標識法 cRNAは、少量の分解RNAでも3’バイアスなしで全長に沿って標識。
タンパク質コードmRNA数 44,122(Human)、48,161(Mouse)、27,770(Rat)
lncRNA数 12,496(Human)、8,393(Mouse)、10,582(Rat)
中サイズncRNA数 Human:1,366(pre-miRNA)、1,642(pri-miRNA)、19(snRNA)、786(snoRNA)
Mouse:701(pre-miRNA)、957(pri-miRNA)、1,229(snRNA)、1,200(snoRNA)
at:432(pre-miRNA)、449(pri-miRNA)、155(snRNA)、1,469(snoRNA)
mRNAソース Human:Refseq, UCSC, GENECODE, FANTOM5 CAT[2-6]
Mouse:Refseq, UCSC, GENECODE[2-3]
Rat:Refseq, Ensembl 92[1, 5]
lncRNAソース
  • Arraystar lncRNA コレクションパイプライン
    2018年までのすべてのデータベースおよび文献からのlncRNA
    各lncRNA遺伝子の転写物に割り当てられた「Canonical」または「longest」の優先順位。
  • 外部データベース(2018年現在)
    Human:Refseq, UCSC, GENCODE, FANTOM5 CAT, LncRNAdb, RNAdb, NRED [2-8]
    Mouse:Refseq, UCSC, GENCODE, GenBank, lncRNAdb, NRED[2-7]
    Rat:Ensembl 92[1], Refseq [5]
  • 文献
    Human: Scientific publications up to 2018[9-45]
    Mouse: lincRNA catalogs[8-11], T-UCRs[12], Evolutionary constrained LncRNAs[13], lncRNA publications up to 2018[14-22]
    Rat:T-UCRs[6-9]
中サイズncRNAソース HumanおよびMouse:GENECODE, miRBase[1-2]
Rat:GENECODE, miRBase, GtRNADb[2-3]
アレイフォーマット 8×60K

リファレンスリスト(PDF):HumanMouseRat
*生物種をクリックするとダウンロードできます。

【circRNA エピトランスクリプトームマイクロアレイ】
プローブ総数 13,617(Human)、14,236(Mouse)、14,145(Rat)
プローブ長 60nt
プローブサイト 環状ジャンクション
プローブ特異性 転写物特異的
標識法 環状RNAの特異的かつ効率的な標識を確実にするためのRNase Rサンプル前処理と組み合わせたランダムプライマー標識。
circRNA数 13,617(Human)、14,236(Mouse)、14,145(Rat)
circRNAソース
  • 外部データベース(2018年現在)
     circbase, CircNet, circRNADb[1-3]
  • 文献
     Human:[4-10]
     Mouse:scientific publications[4-5]
     Rat:scientific publications[4-5]
アレイフォーマット 8×15K

リファレンスリスト(PDF):HumanMouseRat
*生物種をクリックするとダウンロードできます。

解析の流れ

本サービスは、MeRIP、cRNA標識、アレイ実験、アノテーションおよびデータ解析まで、フルパッケージとなっています。

【mRNA & lncRNA 解析ワークフロー】fig.4
  1. RNAサンプルの受け取り
  2. RNAのQCチェック
  3. 免疫沈降(m6A-RIP)
  4. cRNA合成、および2色標識(IP-RNAをCy5標識、およびCy3上清RNAをCy3標識)
  5. アレイハイブリダイゼーション、洗浄、およびスキャニング
  6. データ抽出、アノテーション、解析および要約

【circRNA解析ワークフロー】fig.5
  1. RNAサンプルの受け取り
  2. RNAのQCチェック
  3. 免疫沈降(m6A-RIP)
  4. RNase RによるリニアRNAの除去(rRNA、lncRNA、mRNAなど)
  5. cRNA合成、および2色標識(RIP-RNAをCy5標識、およびCy3上清RNAをCy3標識)
  6. アレイハイブリダイゼーション、洗浄、およびスキャニング
  7. データ抽出、アノテーション、解析および要約
【バイオインフォマティクス解析】
パッケージ内では、以下のような内容の解析が行われます。
  • 異なるm6Aメチル化転写産物(mRNA、lncRNA、および中サイズncRNA)(fig.6
  • 異なるm6Aメチル化転写産物(circRNA)(fig.6
  • 異なるm6Aメチル化RNAの階層的クラスタリングヒートマップ(fig.7
  • 異なるm6Aメチル化mRNAのGOエンリッチメント解析(fig.7
  • 異なるm6Aメチル化mRNAのパスウェイ解析(fig.8

参考文献

  1. Gilbert WV, Bell TA, Schaening C: messenger RNA modifications: Form, distribution, and function. Science 2016, 352(6292):1408-1412.[PMID: 273113037]
  2. Yang Y et al: Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Res 2017, 27(5):626-641.[PMID:28281539]
  3. Alarcon CR et al: HNRNPA2B1 is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events. Cell 2015, 162(6):1299-1308.[PMID:26321680]
  4. Lewis CJ, Pan T, Kalsotra A: RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol 2017, 18(3):202-210.[PMID:28144031]
  5. Qin Y et al: TRIM9 short isoform preferentially promotes DNA and RNA virus-induced production of type I interfe*** by recruiting GSK3beta to TBK1. Cell Res 2016, 26(5):613-628.[PMID: 26915459]

サンプル条件

対応生物種 ヒト、マウス、ラット
サンプルタイプ totalRNA
必要量 【mRNA&lncRNA 解析】推奨量:>10μg、最低量:>5μg
【circRNA 解析】推奨量:>20μg、最低量:>10μg
濃度(Nanodrop に基づく) 推奨>100ng/μL、最低>20ng/μL
純度(Nanodrop に基づく) O.D.260/280:>1.8
O.D.260/230:>1.8
RNA Integrity ゲル電気泳動:18Sおよび28S rRNA のバンドが確認でき、28Sおよび18S rRNA のバンド比が2:1程度であること。
BioAnalyzer:RIN>7.0

* 血清、血漿、エクソソームおよびFFPEなど、分解や断片化され品質低下がよく知られているサンプルに由来するRNAについては、解析結果の品質が低い可能性があります。お客様の同意があれば、ご提出いただいたサンプルで解析を行うことは可能ですが、データ品質が悪い、あるいはデータが取得できない可能性もあり、データ取得の保証はできませんので、予めご注意ください。

* DNase, RNaseフリーの1.5mLまたは2mLのチューブを使用してください。(スクリューキャップ式を推奨)
* ヌクレアーゼフリーの分子生物学グレードの水に溶解し、-80℃で保存してください。
* サンプルは、DNase処理を行うことを推奨します。
*UVスペクトルベースの濃度測定法では、不正確になる場合がありますので、蛍光ベースの測定を強く推奨します。
* UVスペクトルベースで測定した場合、上記よりも多いRNAを準備してください。


ご注文に関して

お問い合わせフォーム よりお問い合わせください。

製品カタログ・リーフレット

参考価格・納期

サービス項目 生物種 価格(税抜) 納期 カタログ#
N6-メチルアデノシトシン(m6A)修飾
mRNA&lncRNA Epitranscriptomic Array
(m6A)受託解析サービス
ヒト ¥220,000 お問い合わせ F-AS-MELRH6-(サンプル数)
マウス ¥220,000 F-AS-MELRM6-(サンプル数)
ラット ¥220,000 F-AS-MELRR6-(サンプル数)
circRNA Epitranscriptomic Array
(m6A)受託解析サービス
ヒト ¥190,000 F-AS-MECRH6-(サンプル数)
マウス ¥190,000 F-AS-MECRM6-(サンプル数)
ラット ¥190,000 F-AS-MECRR6-(サンプル数)
5-メチルシチジン(m5C)修飾
mRNA&lncRNA Epitranscriptomic Array
(m5C) 受託解析サービス
ヒト ¥220,000 お問い合わせ F-AS-MELRH5-(サンプル数)
マウス ¥220,000 F-AS-MELRM5-(サンプル数)
ラット ¥220,000 F-AS-MELRR5-(サンプル数)
circRNA Epitranscriptomic Array
(m5C) 受託解析サービス
ヒト ¥190,000 F-AS-MECRH5-(サンプル数)
マウス ¥190,000 F-AS-MECRM5-(サンプル数)
ラット ¥190,000 F-AS-MECRR5-(サンプル数)

関連サイト



※価格及び、サービスの仕様・内容などにつきまして、予告なしに変更されることがあります。
※表示している参考価格は消費税等は含まれておりません。
※受託サービスは、すべて研究目的として作業を行います。その他の目的(医療品・食品の製造・品質管理や医療診断など)には使用しないで下さい。
※納期は参考納期です。諸事情により、前後する場合がございます。納期の詳細については個別にお問い合わせください。
※会社名・サービス名などは、各社の商標・登録商標です。
※納品物によっては、その構成物(例えば、ベクター、蛍光色素など)の使用に制限がある場合があります。
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 ヒト由来のサンプルの場合、ご所属の組織の倫理委員会などで承認が得られたものが受領されます。
※人間への感染性が疑われるサンプルに関しては、お受けできない可能性がございます。
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