概要
大規模のスクリーニングを行うには高品質のライブラリーが必須です。ベクタービルダーでは、gRNAライブラリー、shRNAライブラリーなどのカスタムライブラリー作製サービスをご提供しています。カスタムライブラリー構築サービスでは、デザインからウイルスパッケージングまでの一連のサービスをご注文いただくほかに、必要な作製ステップのサービスのみをご注文いただくことも可能で、ご要望に合わせてお見積り、納品をいたします。ベクタービルダー社のデザインしたベクターを使ったライブラリーに高い信頼性と豊富な実績があります。またライブラリーを競合他社には追随できない価格で日本ユーザーにお届けします。大腸菌またはウイルス納品の場合は、カルタヘナ法に基づく組み換え生物等の情報公開書類を発行いたします。
主なカスタムライブラリーの特徴
- プール型CRISPRライブラリーの種類とメカニズム
プール型 CRISPR ライブラリーは、大規模またはゲノム単位での、遺伝子コーディング領域やノンコーディング領域の機能性スクリーニングに対して効果的なライブラリーです。このライブラリーを使うことで、目的のパスウェイ、疾病、薬剤処理に対する細胞のレスポンス、発生過程、遺伝子調節などに関わる機能をもつ領域のスクリーニングが行えます。 次の表にCRISPRを使った場合のスクリーニングの種類を比較しています。
| スクリーニングの種類
| メカニズム
| ターゲットとされる機能領域
| アプリケーション
|
| ノックアウト |
hCas9 または Cas9 ニッケースをターゲットサイトのDNAの切断に用います。DNAの切断部位の修復が行われる際、ランダム突然変異（欠失、挿入など）がターゲットサイトに導入されます。 |
主にコーデイング領域 |
主にコーデイング遺伝子の機能欠損クリーニング |
CRISPRa
(転写活性型) |
転写活性化ドメイン(例えば VP64)を融合した酵素不活性型 Cas9 (dCas9) を使います。ターゲットサイト下の遺伝子転写が常に活性化された状態でスクリーニングを行います。 |
主にプロモーター領域と他のノンコーデイングな調節領域 |
コーデイング遺伝子の機能獲得型又はノンコーデイング領域の調節機能のスクリーニング |
CRISPRi
(転写抑制型) |
転写抑制ドメイン(例えば KRAB)を融合した酵素不活性型 Cas9 (dCas9)を使います。 ターゲットサイト下の遺伝子転写が常に抑制化された状態でスクリーニングを行います。 |
主にプロモーター領域と他のノンコーデイングな調節領域 |
コーデイング遺伝子の機能欠損型又はノンコーデイング領域の調節機能のスクリーニング |
All-in-one ベクターシステム、2ベクターシステムの違い：
All-in-oneベクターシステムでは、Cas9 とsgRNAを1つのベクター上で同時発現させます。2ベクターシステムでは、Cas9を乗せたベクター、gRNAを乗せたベクターの2種類を構築します。2ベクターシステムの利点は、Cas9を安定に発現する細胞株を単離し、gRNA発現ベクターを導入できることです。対照的にAll-in-oneベクターシステムの利点は、co-transfectionやco-transductionを避けることができ、Cas9安定発現細胞株がなくともスクリーニングを行える点です。ともにsingle-gRNA, dual-gRNAのデザインに対応しています。しかしAll-in-oneベクターシステムには用途に制限があることや、ウイルスタイターが低くなる場合もあることを念頭に置いてください。
- プール型shRNAライブラリー
プール型shRNAライブラリーは哺乳類細胞で大規模又はゲノムワイドのノックダウンスクリーニングを行うための強力でコストパフォーマンスのよいツールです。CRISPRベースのノックアウトスクリーニングでは生じる変異によっては細胞間でノックアウト効果のばらつきが大きい場合が欠点として考えられています。しかし、shRNAライブラリーは、ターゲット遺伝子に対して、一定のノックダウン効果を得ることが可能です。さらにベクタービルダー社では、カスタムshRNAライブラリー構築はもちろんのこと、ヒトまたはマウスのready-to-use lentivirus shRNAライブラリーもご提供しています。
サービス内容
デザインからウイルスパッケージングまでの一連のサービスをご注文いただくほかに、必要なサービスのみをご注文いただくことも可能です。構築したベクターのプラスミドプールを形質転換し大腸菌の グリセロールストック納品や、ユーザーからご提供いただいたプラスミドプールを増幅しウイルスパッケージングを行って納品するなど、ユーザーのニーズに幅広くご対応いたします。
- ライブラリー作製のストラテジーをデザイン
もしgRNA又はshRNAのシークエンスをお持ちでない場合、VectorBuilderは最適化されたパイプラインと強力なコンピュターのリソースを使用して、ユーザーのターゲット遺伝子またはゲノム領域のgRNA又はshRNA プールのデザインを行います。ユーザーの研究ニーズに応じて、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、piggyBac及びプラスミドなどのライブラリー構築には、ベクタービルダーで通常使用しているベクターバックボーンからの選択や、ユーザー提供のベクターバックボーンからのライブラリー構築を選択できます。2ベクターCRISPRライブラリーでは、ユーザーのスクリーニングストラテジーに適したCas9 又は変異型 Cas9 の発現ベクターをデザインし、ベクターとライブラリーの作製も可能です。
- カスタムCRISPR/shRNAライブラリー作製（プール型）
VectorBuilderは高品質で低エラー率のgRNA又はshRNAのオリゴプールを合成するために、チップベースでオリゴを合成しています。オリゴは最低限のサイクルでPCR増幅し、ターゲットに対して平均100倍以上の representationを保持してベクターバックボーンにクローニングされています。構築されたCRISPR又はshRNA ベクターライブラリーは大腸菌に形質転換され、指数増殖期にグリセロールストックを作成します。ライブラリーの品質の信頼度の評価は、NGSを使ってgRNAまたはshRNA のプラスミドプールについて500倍以上のシークエンスカバーレージを保証することを条件としています。またNGSデータを解析し、プラスミドプール内ですべてのgRNAまたはshRNAが検出されることを確認します。
- 既製プラスミドプールの増幅
他のリソース（例えばAddgeneなど）からの既存プラスミドライブラリーの増幅も受託サービスしています。受け取った既存プラスミドライブラリーは、平均100倍以上の存在量(representation)になるよう、スーパーコンピテントセルを使って形質転換を行います。そして指数増殖期の大腸菌のグリセロールストックを作製します。このようにして作製した大腸菌グリセロールストックを納品する、またはプラスミドDNAをエンドトキシンフリーで精製ご、ご希望のウイルスパッケージングを行い、ウイルスライブラリーの納品にも対応しています。
既存プラスミドプールに含まれている実際の平均gRNA/shRNAの fold representationの検証も行います。 この場合、既存プラスミドプールの形質転換前と大腸菌ストック作製後の両方でNGS検証を行い、fold representationを求めます。ベクタービルダー社作製のライブラリーでは、100倍以上の平均representationを保証しています。しかしユーザー提供の既存プラスミドライブラリープールの場合、ライブラリーの複雑性や均一性のばらつきはベクタービルダー社でコントロールが不可能なため、最終納品物のrepresentation保障は適用できないことを予めご了承ください。
- プールされたライブラリーのウイルスパッケージング
CRISPR/shRNA スクリーニングでは、レンチウイルス またはアデノ随伴ウイルスなどのウイルスを介してプール型ライブラリーを細胞に導入する場合もあります。ベクタービルダー社はタイター、純度、生存率及び均一性に優れたプロトコールと独自技術と試薬を開発しました。
- スクリーニングサンプルのNGSデコンボリューション
ポストスクリーニングサンプルのNGSサービスにも対応しています。抽出したゲノムDNAをベクタービルダー社日本オフィスにお送りください。VectorBuilder は数週間でNGSライブラリーを作成し、イルミナNova-Seqの相乗りでハイスループロットシークエンシングを行います。デコンボリューション後、gRNAまたはshRNAの正確なカウントデータをお届けします。 NGSシークエンスのraw dataと解析済みデータは、ベクタービルダー社クラウドからユーザーのローカルサーバーにダウンロードまたはメディアでの物納品にも対応しています。
- その他のカスタムライブラリー作製（ファージディスプレイ、two-hybridなど）
その他の大規模スクリーニング用カスタムベクターライブラリー構築、ファージディスプレイ、イーストtwo-hybrid、遺伝子発現ライブラリーなど、様々ご要望にお応えします。
