概要

本サービスは、直接的な末端ラベリングとスマートなプローブ設計に基づいたマイクロアレイ技術を利用して、miRNA、pre-miRNA、tsRNA、tRNA、snoRNAといった small RNA を同じアレイ上で同時に検出および定量化し、small RNA の制御およびバイオマーカー研究のための重要な発現情報を提供いたします。

特長

• 主要な small RNA クラスを同時にプロファイリング
  本解析に使用されるマイクロアレイには、miRNA、pre-miRNA、tRNA-derived small RNA(tsRNA)、tRNA および small nucleolar RNA(snoRNA)が搭載されています。これらの small RNA は重要な制御機能と優れたバイオマーカーとしての可能性を持っており、生物科学的および臨床科学的に非常に興味深いものとなっています。small RNA-seq によるプロファイリングでは、異なる生化学的特性を持つ small RNA クラスをカバーするために、ライブラリー構築や分析を別々に行う必要があります。例えば、miRNA-seq と tRNA-seq を一緒に実行し、miRNA と tRNA の両方のバイオタイプをプロファイリングすることはできません。一方で本サービスでは、一度の解析でこれらすべての small RNA を1枚のマイクロアレイ上で同時に分析することが可能です。
• 高感度、高特異性、高精度に低分子RNAをプロファイリング
  本アレイでは、高い親和性のプローブハイブリダイゼーションによって少量の small RNA で高感度な解析を実現しています。プローブデザインには、5’ヘアピン構造と正規化された配列ターゲティング領域が組み込まれており、わずか1～2ヌクレオチドの違いで small RNA を特異的に区別します（詳しくはこちら）。直接的で簡素化された手順により、small RNA-seq や qPCR よりも偏りのない正確な定量を実現しています。また、RNA-seq による small RNA プロファイリングの長年の課題は、RNA修飾、RNAの折り畳み構造、および複雑なライブラリー調整でした。本アレイでは、small RNA は3’-OH末端でCy3と直接ライゲーションされるため、内部RNA修飾を除去するための前処理や、修飾やRNAの折り畳みによる阻害に起因する不完全な逆転写、歪んだPCRの増幅ステップなどを完全に回避することができます。これらにより、ネイティブな small RNA レベルをより忠実に再現し、RNA-seq や qPCR よりも優れた偏りのない高い定量精度を達成しています（詳しくはこちら）。
• 少ないサンプル量
  本アレイは、わずか100ngのトータルRNAで解析することができ、small RNA-seq と比較してもはるかに少量で解析を行うことが可能です。直接、末端ラベリングを行うことで、RNAの損失を引き起こす可能性のある前処理が不要になるため、特に多く修飾されたRNAバイオタイプ（tRNAやtsRNAなど）の場合のインプットRNA量の需要を大幅に削減することが可能です。サンプル量を確保できない様な条件にも柔軟に対応できる可能性が高まります。
• 低品質なRNAサンプルにも耐性
  本サービスによる small RNA プロファイリングでの直接のRNA末端ラベリングは、逆転写によるcDNAコピーに依存しないため、基質RNA配列のヌクレオチド損傷に対して比較的寛容です。これは small RNA 配列に沿ったヌクレオチド損傷に対して脆弱な small RNA-seq とは対照的です。また、マイクロアレイプローブは関連性の無い配列の存在に影響を受けることはありませんが、small RNA-seq の場合は、サンプル中に含まれる rRNA の分解により生じたフラグメントRNAによって、同様のサイズとなる small RNA を汚染し、small RNA のカバレッジを低下させる可能性があります（詳しくはこちら）。

データベース

本サービスは、ヒト、マウスに対応したマイクロアレイをご用意しています。マイクロアレイの構成内容は以下の通りです。

Human small RNA Expression Array V1.0

プローブ総数	14,707
プローブデザイン	プローブ全体には、5’キャップセグメント、small RNA ハイブリダイゼーション用の特定の配列、および3’リンカーが含まれます。
プローブ部位	5-p-miRNAs および 5’tsRNAs：small RNAの3’配列 3-p-miRNAs および 3’tsRNAs：small RNAの5’配列 Pre-miRNA：pre-miRNAのループ配列 tRNA：成熟tRNAのアンチコドンループ配列 snoRNA：snoRNA中の特異的配列領域
プローブ特異性	small RNA 特異的
miRNA のカバレッジ	2,627（1,318 5-p-miRNA および 1,309 3-p-miRNA）
tsRNA のカバレッジ	4,254
pre-miRNA のカバレッジ	1,745
成熟 tRNA のカバレッジ	346
snoRNA のカバレッジ	955
small RNA ソース	miRNA：miRBase(v22) tsRNA：tRFdb, MINTbase, GtRNADb(Updated to 18.1 2019.08) pre-miRNA：miRBase(v22) tRNA：GtRNADb(Updated to 18.1 2019.08), ENSEMBL(v99) snoRNA：ENSEMBL(v99) 参考文献：Scientific publications up to 2019(references 1-40)
アレイフォーマット	8×15K

Mouse small RNA Expression Array V1.0

プローブ総数	14,895
プローブデザイン	プローブ全体には、5’キャップセグメント、small RNA ハイブリダイゼーション用の特定の配列、および3’リンカーが含まれます。
プローブ選択領域	mRNAとLncRNA：転写産物の全長に沿った特定のエクソンまたはスプライスジャンクション
プローブ部位	5-p-miRNAs および 5’tsRNAs：small RNAの3’配列 3-p-miRNAs および 3’tsRNAs：small RNAの5’配列 Pre-miRNA：pre-miRNAのループ配列 tRNA：成熟tRNAのアンチコドンループ配列 snoRNA：snoRNA中の特異的配列領域
プローブ特異性	small RNA 特異的
miRNA のカバレッジ	1,949（966 5-p-miRNA および 983 3-p-miRNA）
tsRNA のカバレッジ	1,809
pre-miRNA のカバレッジ	1,122
成熟 tRNA のカバレッジ	270
snoRNA のカバレッジ	1,323
small RNA ソース	miRNA：miRBase(v22) tsRNA：tRFdb, GtRNADb(Updated to 18.1 2019.08) pre-miRNA：miRBase(v22) tRNA：GtRNADb(Updated to 18.1 2019.08), ENSEMBL(v99) snoRNA：ENSEMBL(v99) 参考文献：Scientific publications up to 2019(references 1-40)
アレイフォーマット	8×15K

ワークフロー

本サービスでは、サンプル調整からデータ解析まで、small RNA のプロファイリングをフルパッケージでご提供しております。ご提供頂いたRNAサンプルの品質チェック（QC）後、以下のステップで解析を行います。

Total RNA 3’末端脱リン酸化（3’-cP、3’-P）	全RNAをT4ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 PNK）で処理し、3’末端から残留リン酸（P）および環状リンさん（cP）基を除去し、3-OHを露出させます。 3-OH末端のsmall RNAは、DMSOによって編成され、ライゲーションによってCy3で酵素的に標識されます。 標識されたRNAは、small RNA発現プロファイルの分析のために、Arraystar small RNA Expression Microarray にハイブリダイズされます。
3’-OH 末端 RNA DMSO変性、Cy3ラベリング
標識 RNA small RNA Microarray とのハイブリダイゼーション AgilentスキャナーG2505Cによるスライドスキャン データ解析（データ抽出、解析、要約）
small RNA プロファイル （miRNA、tsRNA、pre-miRNA、tRNA、snoRNA）

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納品物

解析完了後、弊社報告書の他、以下のデータをDVD等の記録メディアに収録してご提供いたします。

1. 解析ソフトウェア上から精製された全てのマイクロアレイ生データファイル
2. Arraystar社による実施プロジェクトの解析レポート（Word形式）以下のデータを含む解析結果（excel形式）
   ・Rawシグナルおよび正規化された強度データ
   ・fold-change および p-value のカットオフ（通常はFC≧2、p≦0.05）によって差次的に発現した small RNA
   ・miRNA、pre-miRNA、tsRNA、tRNA、snoRNA の詳細なアノテーション
3. ボックスプロットおよびスキャッタープロット
4. 階層クラスタリングヒートアップ
5. ボルケーノプロット
6. サンプルQCレポートおよびマイクロアレイQCレポート（pdf形式）

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サンプル条件

品質条件	詳細
サンプルタイプ	TotalRNA
必要量	推奨量：＞2μg、最低量：＞1μg
濃度（Nanodropに基づく）	推奨＞100ng/μL、最低＞20ng/μL
純度（Nanodropに基づく）	O.D.260/280：＞1.8 O.D.260/230：＞1.8
RNA Integrity	ゲル電気泳動：18Sおよび28S rRNAのバンドが確認でき、28Sおよび18S rRNAのバンド比が2：1程度であること。 BioAnalyzer：RIN＞7.0 ＊ 血清、血漿、エクソソームおよびFFPEなど、分解や断片化され品質低下がよく知られているサンプルに由来するRNAについては、解析結果の品質が低い可能性があります。お客様の同意があれば、ご提出いただいたサンプルで解析を行うことは可能ですが、データ品質が悪い、あるいはデータが取得できない可能性もあり、データ取得の保証はできませんので、予めご注意ください。

＊ DNase、RNaseフリーの1.5mlまたは2mlマイクロチューブを使用してください（スクリューキャップ式を推奨）
＊ ヌクレアーゼフリーの分子生物学グレードの水に溶解し、-80℃で保存してください。
＊ ンプルはDNase処理を行うことを推奨いたします。
＊ UVスペクトルベースの濃度測定法では不正確になる場合がありますので、蛍光ベースでの測定を強く推奨します。
＊ UVスペクトルベースで測定した場合、上記よりも多いサンプルをご準備ください。