Visium 空間的遺伝子発現解析の特徴

6.5 mm x 6.5 mmの区画内に載せた組織から、5,000スポットの細胞を解析できます。1スポットで平均1～10個の細胞を捕捉し、1スポットに1種類のバーコードを付与して位置情報を保ったままmRNA解析が可能です。
1スポット当たり直径55µmの解像度で、スポットの中央点は100µmの間隔で位置しています。（fig.1）
ライブラリ調整前に組織をH&E染色し、染色画像と遺伝子発現解析マップを重ね合わせることで、細胞の特徴と実際の遺伝子発現を比較できます。（fig.2）

マウス 海馬でのVisium解析例（SpaceRanger解析結果へのリンク）

解析可能なサンプル

アプリケーション	Visium FFPE（＊1）	Visium FF（＊2）
サンプル	ホルマリン固定 パラフィン包埋サンプル	新鮮凍結OTC包埋サンプル
動物種	ヒトまたはマウス	動物組織
解析メカニズム	全トランスクリプトームパネルのそれぞれの標的遺伝子に対するプローブを使用して組織中の発現遺伝子を検出する	組織中のmRNAをpolyA鎖を介して捕捉し発現遺伝子を検出する

＊1 FFPE：Formalin-Fixed Paraffin-Embedded
＊2 FF：Fresh Frozen

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サンプル調整のフロー

10x Genomic社のVisium Spatial Kitを使用し以下のフローでサンプルを調整します。（fig.3）
Tissue Optimization=TO（組織透過処理時間の最適化）
Gene Expression=GEX（fig.4）

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サンプル受け入れ条件

Visium FFPE	Visium FF（新鮮凍結）
・HE染色・イメージングし、崩れがないことを確認している ・切片のサイズはキャプチャーエリア（6.5 mm x 6.5 mm）以内に収まること
薄切片を5μm以下で切り出せること	薄切片を10 μm以下で切り出せること
（KOTAIバイオテクノロジーズへ委託可能）サンプルのVisiumテストスライドへの接着性に問題がないこと 組織の固定方法、包埋方法、組織のタイプ、切り出し方法、スライドへの搭載の仕方などが接着性に影響を及ぼすと言われています。接着性はVisium接着テストで確認することができます。	包埋方法はOCTのみ。 規定品を使用していること Tissue-Tek* O.C.T. Compound 25608-930（サクラファインテック） 既定の方法で凍結し、組織切片を作製・切り出していること
	（KOTAIバイオテクノロジーズへ委託可能） GEXの解析を行うサンプルは、TOによる細胞透過酵素の反応時間を検討済みである
サンプル中のRNAの品質が高いこと (KOTAIバイオテクノロジーズへ委託可能)FFPEから薄片を切り出しRNA抽出を行い、DV200が50%以上であることを確認していること	サンプル中のRNAの品質が高いこと （KOTAIバイオテクノロジーズへ委託可能） 事前に、OCT包埋組織から薄片を切り出しRNA抽出を行い、RIN値が７以上であることを確認していること
外部リンク：Visium Spatial Gene Expression for FFPE – Tissue Preparation Guide	外部リンク：Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide

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事前提出いただくデータ

ご委託時に以下のデータを確認させていただきます。いずれもKOTAIバイオテクノロジーズ社に委託可能です。

• HE染色画像：ダメージの少ない組織切片であることを確認します。
• FFPEサンプルの場合：組織のDV200値：50%以上あることを確認します。
• 新鮮凍結サンプルの場合：組織のRIN値：7以上あることを確認します。

参考画像（fig.5）（fig.6）

【FFPEサンプルの場合】

組織のご準備	事前にRNAを抽出し、DV200が50％以上であることをご確認ください。 またそれぞれのサンプルの接着テストを実施してください
（KOTAIバイオテクノロジーズ社へ委託可能） 切片からDV200値を測定 HE染色画像を取得	厚さ5 μmの切片を4枚程度使用いただき、RNA抽出してください。DV200値が50%以上のサンプルを受託対象としております。
切片をGene Expression用 スライドに載せる	Gene Expression 解析を行う組織切片を、スライドに載せていただきます。厚さ5 μmで作製いただき、1スライド当たり4枚の切片を解析できます。 6.5mm x x6.5mm のキャプチャーエリア内に収まるように切片を配置してください。キャプチャーエリアの端は遺伝子検出率が極端に低くなります。
Gene Expressionライブラリ作製	細ハイブリダイゼーションさせたRNAプローブからcDNAを作製します。 スライドの位置情報を含んだバーコードをもったライブラリが完成します。
シーケンス	3億ペアリード/サンプルで解析します。それ以上をご希望の場合はご相談ください。
Space Ranger解析	Space Ranger (10x Genomics社製ソフト)を用いた解析を行います。
Loupe Browser解析	Loupe Browser (10x Genomics社製ソフト)を用いた解析を行います。

【新鮮凍結サンプルの場合】

組織のご準備	解析する組織を既定のOCT（Tissue-Tek* O.C.T. Compound 25608-930（サクラファインテック））で包埋してください。 事前にRNA抽出し、RIN値が7以上であることをご確認ください。
（KOTAIバイオテクノロジーズ社へ委託可能） 切片からRIN値を測定 HE染色画像を取得	厚さ10 μmの切片を10枚使用いただき、RNA抽出してください。RIN値が7以上のサンプルを受託対象としております。
切片をTissue Optimization用 スライドに載せる	Tissue Optimization用に厚さ10 μmの切片を作製いただき、7枚をスライドに載せていただきます。7枚は全て同じ種類の組織としてください。
（KOTAIバイオテクノロジーズ社へ委託可能） Tissue Optimization	細胞透過酵素の処理時間を検討し、最適な透過時間を決定します。 サンプルごとに検討が必要になります。
切片をGene Expression用 スライドに載せる	Gene Expression 解析を行う組織切片を、スライドに載せていただきます。厚さ10 μmで作製いただき、1スライド当たり4枚の切片を解析できます。 6.5mm x x6.5mm のキャプチャーエリア内に収まるように切片を配置してください。キャプチャーエリアの端は遺伝子検出率が極端に低くなります。 1つのキャプチャーエリアに一種類の組織を乗せてください。異なる組織を載せると、酵素処理が適切にできません。
Gene Expressionライブラリ作製	細胞を透過させ、RNAからcDNAを作製します。 スライドの位置情報を含んだバーコードをもったライブラリが完成します。
シーケンス	3億ペアリード/サンプルで解析します。それ以上をご希望の場合はご相談ください。
Space Ranger解析	Space Ranger (10x Genomics社製ソフト)を用いた解析を行います。
Loupe Browser解析	Loupe Browser (10x Genomics社製ソフト)を用いた解析を行います。