コンベンショナルノックアウトマウス作製 ID: J00988

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コンベンショナル・ノックアウトマウス（完全ノックアウトマウス、単純ノックアウトマウスともいいます）の作製サービスを提供いたします。

カテゴリ

サービスについて

概要

安評センターでは、コンベンショナル・ノックアウトマウス（完全ノックアウトマウス、単純ノックアウトマウスともいいます）の作製サービスをご提供いたします。
標的となる遺伝子のエキソンを薬剤耐性遺伝子で置き換えることにより、全身の細胞で標的遺伝子を破壊いたします。
標的遺伝子名をお知らせください。遺伝子情報に基づき、相同組換えベクター設計をご提案させていただきます。

特長

ご希望内容に応じて種々のストラテジーを提案
全身の細胞で標的遺伝子が破壊される
CRISPR/Cas9での受精卵インジェクション法、C57BL/6N由来ES細胞での相同組換え法で対応可能

作業概要

工程	作業内容
相同組換えベクターの構築	1. 標的遺伝子に関する情報をデータベースにより取得し、デザイン案を作製 2.相同組換え領域のクローニング 3.クローニング産物と薬剤耐性遺伝子の組み合わせにより、相同組換えベクターを構築 4.スクリーニング条件設定のためのコントロール・ベクターを作製
組換えES細胞株の樹立	5. ES細胞株へのエレクトロポレーション 6. 薬剤耐性ESクローンのピックアップ 7. PCRによるスクリーニング 8. PCR解析、Neoプローブによるサザンブロット解析により、相同組換えESクローンを樹立
キメラマウス作製	9.最大3クローンの相同組換えES細胞を用いて、キメラマウス作製（全てのキメラマウスがES細胞寄与率80%を下回る場合、再作業）
ヘテロマウス作製	10. 自然交配による生殖系列キメラマウスの同定（ES細胞寄与率上位4匹のキメラマウスを、野生型マウスと交配） 11. 第1世代（F1）ヘテロマウスの取得

工程	作業内容
薬剤耐性遺伝子の除去	F1ヘテロマウスとCAG-Flpマウス（あるいは、CAG-Creマウス）との交配により、薬剤耐性遺伝子を除去。さらに、野生型マウスと交配させ、Flpトランスジーン（あるいは、Creトランスジーン）を除去

オプション：スキップサービス
（キメラマウスとCAG-Flpマウスの交配により生殖系列移行と薬剤耐性遺伝子除去を同時実施）

工程	作業内容
薬剤耐性遺伝子除去スキップサービス	ES細胞寄与率上位のキメラマウスとCAG-Flpマウスの自然交配の実施（＊1） PCR解析による薬剤耐性遺伝子が除去された第1世代（F1）マウスの同定薬剤耐性遺伝子が除去されたF1マウスと野生型マウスの自然交配の実施（＊1） PCR解析によるCAG-Flpトランスジーンが除去された第2世代（F2）マウスの同定 8週齢までのF2ヘテロマウスの飼育

工程

作業内容

薬剤耐性遺伝子除去
スキップサービス

ES細胞寄与率上位のキメラマウスとCAG-Flpマウスの自然交配の実施（＊1）
PCR解析による薬剤耐性遺伝子が除去された第1世代（F1）マウスの同定
薬剤耐性遺伝子が除去されたF1マウスと野生型マウスの自然交配の実施（＊1）
PCR解析によるCAG-Flpトランスジーンが除去された第2世代（F2）マウスの同定
8週齢までのF2ヘテロマウスの飼育

コンベンショナルKOマウスの作製はCRISPR / Cas9での実施も可能です

工程	作業内容
ガイドRNAの活性確認 ssOligoの合成	標的遺伝子配列に対するガイドRNAの選択（最大2種類）選択ガイドRNA配列を組み込んだcrRNAの合成 Cas9タンパク質とtracrRNAの準備標的配列切断活性のin vitro評価 ssOligoDNAの合成
受精卵インジェクション	前核期受精卵（C57BL/6N系統）へのインジェクションと移植産子の組織採取 8週齢までの産子飼育
ダイレクトシークエンスによる遺伝子変異の検出	解析条件の決定ダイレクトシークエンス解析（判読可能な場合は変異導入配列を確認）
自然交配による次世代作製（F1ヘテロマウスの取得）	指定のファウンダーマウスを用いた自然交配の実施産子の組織採取 8週齢までの産子飼育ダイレクトシークエンスによる第1世代（F1）マウスの同定

ES細胞を用いた相同組換え法での実施例（fig.1）

構築した遺伝子改変用ベクターをエレクトロポレーションによりES細胞に導入します。PCRによる1次スクリーニング、詳細解析、Neoプローブによるサザンブロット解析により、相同組換えES細胞を樹立します。

fig.1 ES細胞を用いた相同組換え法での実施例

樹立した相同組換えES細胞からマウス作製（fig.2）

樹立した相同組換えES細胞よりマウスを作製します。計画通り遺伝子改変用ベクターが挿入されたES細胞（最大3クローン）からキメラマウスを作製します。F1マウスを作製し、相同組換えES細胞が生殖系列へ移行しているかを確認、ヘテロマウスを取得いたします。

fig.2 樹立した相同組換えES細胞からマウス作製

納品

お客様のご都合に合わせて、当社からマウスを納品します。通常はF1ヘテロ接合体マウスを納品しますが、ご希望に応じてキメラマウス（F0ファウンダーマウス）・ホモ接合体マウスの納品、凍結胚・精子での納品、マウス増産後の納品も可能です。

ご注文に関して

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参考価格・納期

作業工程	納期	価格（税抜）
相同組換えベクターの構築	2～3ヶ月	￥880,000
組換えES細胞株の樹立	3～4ヶ月	￥1,400,000
キメラマウス作製	約3ヶ月	￥700,000
ヘテロマウス作製	約3ヶ月	￥700,000
合計		￥3,680,000

＊納品にかかる微生物検査費、輸送費は別途必要です。

作業工程	納期	価格（税抜）
薬剤耐性遺伝子の除去	約6ヶ月	￥900,000

＊上記価格・納期は当社標準の作業内容の場合となります。ご希望内容によっては価格・納期共に変動することがございます。

作業工程	納期	価格（税抜）
薬剤耐性遺伝子除去スキップサービス	約6ヶ月	￥1,700,000