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組換えタンパク質の発現精製

概要

遺伝子（DNA）配列、あるいはアミノ酸配列が分かっているタンパク質を、遺伝子組換えの手法を用いて宿主細胞に生産させ、さらに生産されたタンパク質を分離・精製して提供するサービスです。
コンストラクトの設計から精製方法の選択まで、対応いたしますのでお気軽にお問い合わせください。

［こんな人にオススメ］

• 抗体作製に利用する抗原タンパク質あるいは抗原ペプチドを製造したい。
• 機能解析、立体構造解析に用いるタンパク質を製造したい。
• 構造を改変したタンパク質を製造したい。

サービスの流れ

1. 発現ベクターの構築
   タンパク質発現用ベクターおよび目的タンパク質をコードするDNAをご提供いただき、発現ベクターを構築します。
   目的タンパク質をコードするDNAをお持ちでない場合も、人工遺伝子合成から対応することが可能です。
2. 発現トライアル
   タンパク質発現用ベクターを宿主へ導入し、小スケールでタンパク質の発現を行います。
   基本的には、SDS-PAGEにて発現の有無・発現量を確認します。タグあるいは融合タンパク質として発現させる場合には、それらタグを指標とする確認を行います。ウェスタンブロットに使用可能な抗体が入手できる場合には、オプションにてウェスタンブロットによる発現確認を行います。発現トライアルが、以上のような一般的な検出方法でなく、生産物に固有な検出法あるいは部分精製法を必要とする場合にも、ご相談に応じます。
3. 発現条件の至適化
   トライアルにて良好な結果が得られなかった場合には、オプションで発現条件の至適化を実施することも可能です。
   ベクターの構造、宿主、誘導条件、培養条件について検討します。
   得られた組換えベクターならびに組換え生産細胞は、別途ライセンス契約等による場合を除き、お客様に提供します。
   ＊至適化試験の一部のみを実施することも可能です。詳しくはお問い合わせください。
4. 大量培養
   発現トライアル、発現条件の至適化による生産条件を基に、大量培養を行います。
   1リットル程度のフラスコ培養、50-70リットル、または、それ以上のジャーファーメンター培養をベースとした大量培養の実施が可能です。
5. タンパク質精製
   目的タンパク質の精製を行います。
   封入体精製、塩析、各種クロマトグラフィー（アフィニティー、イオン交換、疎水性、ゲルろ過）、エンドトキシン除去などを実施します。
   また、必要に応じて変性したタンパク質を活性型タンパク質への巻き戻し（リフォールディング）の検討を行います。

＊ 注意
期待した収量・純度が得られなかった場合にも、費用が必要になります。

各発現系の特徴（fig.1）

• 大腸菌（E. coli）
  ・多様な宿主・ベクター系が市販されており、様々なターゲットに適応できます
  ・高発現のため安価に生産が可能です
  ・封入体を形成することがあります
• ブレビバチルス（Brevibacillus choshinensis）
  ・タンパク質を培地中に分泌生産することが可能です
  ・分泌タンパク質を正しい構造で生産できます
  ・菌体外プロテアーゼが少ないので、培養中の分解が生じません
  ・グラム陽性菌のため、エンドトキシンがありません
• 哺乳動物細胞（HEK293, COS-7等）
  ・活性型の構造をもったタンパク質が取得しやすい
  ・糖鎖などの翻訳後修飾が可能です
• 大腸菌無細胞翻訳系
  ・毒性をもつなど細胞内で生産できないタンパク質の生産が可能です
  ・界面活性剤などの各種添加剤存在下での生産が可能です
  ・直鎖の鋳型を使用できるので、ハイスループットでの発現確認を行なえます

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リスク

• 目的タンパク質や発現系によっては、発現が困難である、または目的の発現量が得られない場合があります。
• 目的タンパク質や発現系によっては、目的の純度まで精製できない場合があります。
• 目的タンパク質によっては、高次構造を回復させること（リフォールディング）が困難な場合があります。
• 生産されたタンパク質が溶解しない、あるいは溶解しても、吸着性や会合性が高いために、精製タンパク質として回収することが困難な場合があります。
• タンパク質の生産量は個々のタンパク質によって大きな違いがあり、必ずしも予想できません。場合によっては、お客様が期待する量のタンパク質をご提供するために
必要なコストが、お客様の予想を上回ることがあります。

リスクへの対応について
上記リスクを踏まえ、作業に入る前の打ち合わせ、ならびに作業開始後の中間報告を実施します。
中間報告では、作業の継続もしくは中止を確認し、リスクをコントロールできるよう対応させていただきます。 ページ先頭へ戻る

必要な条件

• 目的遺伝子について
  ・ 由来生物種
  ・ 遺伝子名
  ・ DDBJ accession number
  ・ 合成配列の場合は、配列情報および予想される機能
• タンパク質発現用ベクターおよび宿主細胞について
  ・ベクター名および宿主細胞
  ・メーカー / カタログ番号
  ・タグや融合タンパク質は必要ですか？
  ・種類（配列）
  ・付加位置
  ・精製後に切断する必要はありますか？
• 参考文献
  目的タンパク質のみならず、類似タンパク質を発現・精製した論文であっても重要な資料となり得ます。
  お手持ちの文献がありましたらご提供ください。
• 目的タンパク質について
  ・溶解性および溶解に適した溶液条件
  ・安定性および安定な条件（pH、塩類、保存温度など）
  ・病原性および感染性について
  ・病原性および感染性のある遺伝子および宿主は、受け入れることができません。
  　あらかじめ、病原性および感染性のないことをご確認ください。
• その他
  ウェスタンブロッティングによる検出に使用できる抗体をご提供いただくことは可能ですか？