■ウェスタンブロットの流れ
タンパク質電気泳動には、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、等電点電気泳動、二次元電気泳動があり、ウェスタンブロッティングにはSDS-PAGEがよく用いられます。
- ゲルの選択
- 目的タンパク質の分子量が既知なら、そのタンパク質がゲルの中央に来るようにゲル濃度を選択する。
不明ならグラジエントゲルを使用する。 - サンプルの調製
- 一般的には還元処理後に電気泳動を行う場合が多いが、DTTやメルカプトエタノールなどの還元剤で処理することでタンパク質の立体構造が変化し、一次抗体が反応しなくなる場合がある。その可能性が考えられる場合には、予め非還元処理のサンプルも用意する。
- 分子量マーカーの選択
- メンブレンに正しく転写されたかどうかの確認ができる着色マーカーを利用するとよい。
但し、着色マーカーはタンパク質に色素が結合しているため正確な分子量の測定には適さない。
分子量も推定したい場合には、実験に適した発光検出マーカーを選択する。 - コントロールサンプルの設定
- 電気泳動や転写が問題なくできていることを検証するためにも、目的サンプルと同時にネガティブコントロールとポジティブコントロールも用意しておくとよい。
- 比較サンプルの設定
- 転写効率や検出系においてメンブレン間に差が出る場合がある。比較すべきサンプルは同一のゲル上で泳動を行う。
電気泳動ゲルからメンブレンにタンパク質を転写します。
タンパク質の転写には一般的にエレクトロニックトランスファー（通電による転写）が用いられます。
タンパク質の転写には一般的にエレクトロニックトランスファー（通電による転写）が用いられます。
- 転写装置の選択
- ブロッティング装置にはタンク式とセミドライ式がある。タンク式は転写効率が高く均一な転写が望めるが、バッファー量が多く、冷却しながら長時間を要する。一方、セミドライ式は短時間で転写ができ、少ないバッファー量で済む。高分子タンパク質や塩基性タンパク質は転写効率が低いので、タンク式が適している。
- メンブレンの選択
- メンブレンにはPVDF（ポリビニリデンジフロライド）とニトロセルロースがある。PVDFはタンパク質と結合性が高く、高感度で破れにくく、リプロービングにも適している（使用前にメタノールで親水化が必要）。一方、ニトロセルロースは親水化は不要であるが破れやすい。
転写したメンブレンに検出用の抗体が非特異的に結合することを防ぐため、メンブレン上の転写されていない部分のブロッキングが重要です。
- 転写面のマーキング
- 転写したメンブレンの転写面がわからなくなる場合がある。電気泳動に着色分子量マーカーを加えるか、転写後ブロッキングをする前にメンブレンの一角をほんの少し切り落としておくとよい（ 切り落とす方向を自分で決めておく）。
- ブロッキング剤の選択
- 特定のブロッキング剤だけでは効果がない場合がある。また、過剰なブロッキングは抗原抗体反応や標識抗体の酵素活性を阻害する場合があるので、数種のブロッキング剤を用意して実験系に適したブロッキング剤をドットブロットで予備検討しておく。
★この先はメンブレンを乾かさないよう注意して作業を行う。
▶洗浄
ウェスタンブロッティングの各工程の間には必ず洗浄工程が必要です。
洗浄により未反応の試薬を除去してバックグラウンドを抑えます。
ウェスタンブロッティングの各工程の間には必ず洗浄工程が必要です。
洗浄により未反応の試薬を除去してバックグラウンドを抑えます。
- 洗浄バッファーの選択
- PBSまたはTBSバッファーが一般的。目的タンパク質や検出試薬によって選択する。洗浄バッファーにはHRPを阻害するアジ化ナトリウムが含まれない方がよい。リン酸化タンパク質にはTBSまたはTween20入りTBSが適している。
- Tween20の添加
- 必要に応じて洗浄バッファーにTween20（終濃度0.05%）を添加し、メンブレンが十分浸る量で洗浄する。
目的タンパク質を検出する一次抗体溶液を用いて反応を行います。
- 一次抗体の選択
- 抗体には、1つのエピトープを認識するモノクローナル抗体と様々なエピトープを認識するポリクローナル抗体がある。また、一次構造を認識するものと立体構造を認識するものがあり、後者は目的タンパク質を変性または還元すると結合しなくなる。抗体作製時の免疫抗原が変性タンパク質の場合は、変性タンパク質にのみ結合し非変性のタンパク質には反応しない場合がある。ウェスタンブロッティング用の一次抗体は多数販売されている。購入する際には上記の点を念頭に置いて、同じ抗原名の抗体であっても抗体の特徴を製品データーシートなどで十分調べて選択する。できれば特異性が高いモノクローナル抗体を使用するとよい。
- 反応方法
- 最も失敗の少ない方法は、高い希釈率で薄い濃度に調製した抗体溶液をトレイに用意し、メンブレンを浸して振盪しつつ、4℃、O/Nで反応を行う方法である。抗体の使用量が限られる場合はハイブリダイゼーション用バッグの使用が便利だが、十分に気泡を抜くことが重要である。
▶洗浄
ウェスタンブロッティングの各工程の間には必ず洗浄工程が必要です。
洗浄により未反応の試薬を除去してバックグラウンドを抑えます。
ウェスタンブロッティングの各工程の間には必ず洗浄工程が必要です。
洗浄により未反応の試薬を除去してバックグラウンドを抑えます。
- 洗浄バッファーの選択
- PBSまたはTBSバッファーが一般的。目的タンパク質や検出試薬によって選択する。洗浄バッファーにはHRPを阻害するアジ化ナトリウムが含まれない方がよい。リン酸化タンパク質にはTBSまたはTween20入りTBSが適している。
- Tween20の添加
- 必要に応じて洗浄バッファーにTween20（終濃度0.05%）を添加し、メンブレンが十分浸る量で洗浄する。
一次抗体を検出するために標識二次抗体を使用します。予め適正使用量をドットブロットで検討しておきます。
- 二次抗体の選択
- 様々なホストから得られた二次抗体があるが、バックグラウンドが高い場合はホストが異なる二次抗体に換えるだけでバックグラウンドを低減できる。ホスト以外の動物種由来の血清タンパク質に対する吸収操作を行った抗体も販売されている。動物種を確認して検出方法により最適な抗体を選択する。
HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識二次抗体を用いて化学発光で検出する方法が一般的である。そのほかAP（アルカリフォスファターゼ）標識抗体（発色物質で検出）、蛍光物質や放射性同位体で標識された二次抗体なども用いられる。
▶洗浄
ウェスタンブロッティングの各工程の間には必ず洗浄工程が必要です。
洗浄により未反応の試薬を除去してバックグラウンドを抑えます。
ウェスタンブロッティングの各工程の間には必ず洗浄工程が必要です。
洗浄により未反応の試薬を除去してバックグラウンドを抑えます。
- 洗浄バッファーの選択
- PBSまたはTBSバッファーが一般的。目的タンパク質や検出試薬によって選択する。洗浄バッファーにはHRPを阻害するアジ化ナトリウムが含まれない方がよい。リン酸化タンパク質にはTBSまたはTween20入りTBSが適している。
- Tween20の添加
- 必要に応じて洗浄バッファーにTween20（終濃度0.05%）を添加し、メンブレンが十分浸る量で洗浄する。
検出方法には化学発光法と発色法、蛍光法があります。発色法は簡便ですが、検出感度の高さは化学発光法がはるかに優れており、よく使用されます。化学発光検出では、基質が二次抗体のHRPにより分解される際の発光により、目的タンパク質の有無や量を検出します。
蛍光法は複数のターゲットタンパク質を同時に検出することができます。
ここでは化学発光法と発色法、蛍光法の留意点について記載します。
蛍光法は複数のターゲットタンパク質を同時に検出することができます。
ここでは化学発光法と発色法、蛍光法の留意点について記載します。
- 各試薬のプロトコールに従って繰り返し実験を行い、最適な条件を検討する。
★転写されたメンブレンをラップ上に置き、全体を覆うように満遍なく検出試薬をかける。
発光が持続している間は、露光条件をかえて複数回検出できる。
★目的タンパク質の濃度、抗体使用濃度により露光条件が異なるので予備検討が必要である。 - ストリッピング・リプロービング
- 専用バッファーを用いて一次抗体、二次抗体および検出試薬をメンブレンから除去することで、同メンブレン上で目的タンパク質や他のタンパク質を再度検出でき、検出条件の最適化や検討を行なうことが出来る。
- 不溶性の反応物を生じる基質をもちいて、メンブレン上で直接発色させる手法。
代表的な基質としては、DAB(3, 3'-diaminobenzidine)、BCIP(bromo chloro indolylphosphate)がある。
この検出法では、検出に必要な試薬は発色の基質のみである。特別な設備は不要の検出法で、目視で結果を確認できる。一方で、検出の感度には限りがあり、ngオーダーが検出限界の目安となる。また、DABには毒性があるので、使用と廃棄には注意が必要。検出の結果はメンブレン上の着色として現れる。そのためリプロービング*1が困難であり、実験結果の保存のためには別途可視スキャナーが必要。*1：ブロットしたメンブレンを再利用し、別の抗体を用いて1度目のターゲットとは別の分子の検出を行うこと。
- メンブレン
- 高感度な蛍光検出を行うためには、メンブレンのバックグラウンドを最小限に抑えることが重要である。
PVDFメンブレンの場合：一般的なPVDFメンブレンではなく、低蛍光PVDFメンブレンを使用する。
ニトロセルロースメンブレンを用いる場合：サポート付ニトロセルロースメンブレンは適さない。一般的なニトロセルロースメンブレンはそのまま使用できる。
- 分子量スタンダード
- 赤やピンク色のバンドが含まれるスタンダードは、検出時に強い光を発するため使用を控える。
- 2次抗体
- HRP標識抗体から蛍光標識抗体へ変更する必要がある。
- 遮光
- 蛍光退色を防ぐため、2次抗体の反応ステップからアルミホイル等で遮光する必要がある。
- 撮影
- ラップやフィルムは使用する蛍光波長によってはバックグラウンドが上昇する場合がある。メンブレンの撮影にはラップやフィルムで挟まず、撮影装置にそのまま設置する。
