特長

• Small RNAは、non-coding RNA（ncRNA）の一種です。遺伝子発現に大きく影響を与えることが知られているmiRNA やスプライシングに関わるとされるsmall nuclear RNA （snRNA） などのSmall RNA を網羅的に解析します。
• 遺伝子発現に大きく影響を与えることが知られているmiRNA、および生殖細胞におけるトランスポゾン抑制に関わるpiRNA、およびmiRNAを含むSmall RNA の発現量比較や標的遺伝子予測などを行います。
• 各種サンプルに対応しています。微量サンプルの解析に力を入れており、とくにエクソソーム由来Small RNAを用いた解析の実績が豊富です。
  ・細胞・組織由来の total RNA
  ・血清・血漿 由来 total RNA
  ・血中エクソソーム RNA
  ・血中 cfRNA
• 解析対象に応じて下記のキットをご利用いただけます。
  ・miRNA-seq　(miRNA、piRNA) QIAseq miRNA Library Kit（Qiagen社）
  ＊ 分子バーコードUnique Molecular Indices（UMI）対応,br> ・Small RNA-seq　(miRNA、 siRNA、 piRNA 、scRNA、snoRNA) SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech社）

概要

1	サンプルのクオリティチェック
2	シーケンスライブラリー調製
3	シーケンス
4	データ解析

1. サンプルのクオリティチェック（QC）を行います。
2. miRNAまたはSmall RNAを対象としたシーケンスライブラリーを調製します。
   ライブラリー調製試薬
   QIAseq miRNA Library Kit（Qiagen社）
   SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech社）
3. 調製したシーケンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シーケンサー（NextSeq 500, NovaSeq 6000, Hiseq Xなど）でシーケンスします。
4. シーケンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、発現量を定量化（正規化）し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルを作成します。デフォルトでは、TMMで定量化します。ご要望に応じて、 Small RNAの分類、発現変動遺伝子抽出、時系列解析、ターゲット遺伝子予測などの解析を実施します。

データ解析

miRNAの解析（ライブラリー調整キット：QIAseq miRNA Library Kit）（fig.1）

1. リードの品質の評価を行います。
2. QIAGEN社クラウドサーバー（GeneGlobe Data Analysis Center）により、シーケンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、分子バーコード（UMIs）によるPCR重複の除去を行い、リードカウントをします。
3. small RNA組成の分類を行います。
4. サンプル間のリードカウントを補正するために正規化（TMM等）を行います。
5. 階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6サンプル以上の場合）。
6. ご指定の比較に沿って、変動するmiRNA等を抽出します。
7. miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
8. 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
9. 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことができます。

解析内容は統計解析（データ解析）のページをご参照ください。

Small RNAの解析（ライブラリー調整キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）（fig.2）

1. リードの品質の評価を行います。
2. シーケンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）します。
3. small RNA組成の分類を行います。
4. サンプル間のリードカウントを補正するために正規化（TMM等）を行います。
5. 階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6サンプル以上の場合）。
6. ご指定の比較に沿って、変動するmiRNAおよびSmall RNA等を抽出します。
7. miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
8. 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
9. 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。

解析内容は統計解析（データ解析）のページをご参照ください。

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納品物

miRNAの解析（ライブラリー調整キット：QIAseq miRNA Library kit）
・original_fastq（FASTQ生データ）
・サンプルQC結果（品質検査結果）
・データQC結果（FastQC、MultiQC）
・データ解析結果（正規化、変動miRNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析）

Small RNAの解析（ライブラリー調整キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）
・original_fastq（FASTQ生データ）
・Trimmed_fastq（トリミング済みFASTQ）
・Bam（アライメントデータ）
・サンプルQC結果（品質検査結果）
・データQC結果（FastQC、MultiQC）
・データ解析結果（正規化、変動miRNA抽出、変動Small RNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析）

＊ USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します。

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サンプルについて

	RNA量	濃度	OD260/280	RIN値	送付液量
total RNA（microRNA含む）	1μg以上	100ng/μL以上	1.5以上	8以上	10μL以上
濃縮Small RNA	500ng以上	50ng/μL以上	1.5以上	-	10μL以上
エクソソーム 分画由来 total RNA （miRNA含む）	1ng程度（＊1）	-	-	-	10μL以上
RNA抽出する 血清または血漿					400μL以上
エクソソーム分画	（＊2）	-	-	-	（＊2）
エクソソーム分離後 にRNA抽出をし、 miRNA-seqをする 血清・血漿・培養上清	-	-	-	-	細胞培養上清：15mL以上 血清・血漿：2mL以上

＊1 エクソソーム分画由来 total RNA は1ng からシーケンスライブラリー調製が可能ですが、
　　全量で10ngを下回るサンプルはクオリティチェックが実施できません。ご注意ください。
＊2 超遠心等で分画したエクソソーム分画の送付量については、予めご相談ください。

・RNA抽出の際はカラムを使用し、有機溶媒が混入しないようにしてください。
・サンプル量が上記に満たない場合はお気軽にご相談ください。
・採血の際に使用する抗凝固剤はEDTAをお使いください。
　ヘパリン使用の場合には、ヘパリナーゼ処理が必要になります。
・培養上清からエクソソームを分離して解析を行う場合、FBSにはウシ由来エクソソームが含まれているので
　FBSフリーで培養することをおすすめします。
　FBSフリーでの培養が困難な場合、ウシ胎児血清中のエクソソームを除去するキットのご利用をおすすめします。
・送付方法はサンプル送付方法をご確認ください。