特長
RNA-Seq同様、 miRNA-Seq・Small RNA-Seqでもさまざまなサンプルに対応した解析を行っております。
- 細胞・組織由来 RNA
- 血清・血漿由来 RNA
- 培養上清・血中エクソソーム RNA
細胞や組織由来RNAのほか、血清、血漿由来のセルフリーRNA（cfRNA）にも対応しており、近年、盛んに研究されているリキッドバイオプシーについても解析することができます。リキッドバイオプシーは体液に含まれる核酸を検出する技術であり、がんの検査などにも使われるようになってきました。
とくにエクソソーム中のmiRNAの解析に関しては実績が豊富にあり、近年では動脈硬化疾患に関するプロジェクトに参画しております。
「2021年1月14日プレスリリース 動脈硬化性疾患を対象とした共同研究プロジェクトへの参画 」
miRNA-Seq・Small RNAシーケンスとは
miRNA-Seq・Small RNA-Seqは、次世代シーケンサーを用いてnon-coding RNA（ncRNA） の一種であるマイクロRNA（miRNA）やSmall RNAの配列情報を網羅的に読み取ります。その得られた配列情報を生物種別の既知の配列（リファレンスゲノム）にアライメントすることで、どのSmall RNAが発現しているか数値（発現値）に変換することで遺伝子発現を調べる解析手法です。
概要
| 1 | サンプルのクオリティチェック |
| 2 | シーケンスライブラリー調製 |
| 3 | シーケンス |
| 4 | データ解析 |
- サンプルのクオリティチェック（QC）を行います。
- miRNAまたはSmall RNAを対象としたシーケンスライブラリーを調製します。
ライブラリー調製試薬
QIAseq miRNA Library Kit（Qiagen社）
SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech社）
- 調製したシーケンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シーケンサー（NextSeq 500, NovaSeq 6000, Hiseq Xなど）でシーケンスします。
- シーケンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、発現量を定量化（正規化）し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルを作成します。デフォルトでは、TMMで定量化します。ご要望に応じて、 発現変動遺伝子抽出、時系列解析、ターゲット遺伝子予測などの解析を実施します。正規化以降の解析をご依頼いただいた場合には、 6サンプル以上の場合で階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います。
データ解析
miRNAの解析（ライブラリー調整キット：QIAseq miRNA Library Kit）（
fig.1）
- リードの品質の評価を行います。
- QIAGEN社CLC Genomics Workbenchにより、シーケンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、分子バーコード（UMIs）によるPCR重複の除去を行い、リードカウントをします。
- サンプル間のリードカウントを補正するために正規化を行います。
- ご指定の比較に沿って、変動するmiRNA等を抽出します。
- miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。遺伝子予測データベースであるTargetScan等を利用します。
- 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。複数ある遺伝子の特徴を客観的につかむことが出来ます。
- Pathway解析では、Wikipathwaysに登録されたPathway上に、予測された遺伝子をmiRNAの発現情報（UP/DOWN）で色分けしPathway画像を作成します。
さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことができます。
解析内容は
統計解析（データ解析）のページをご参照ください。
Small RNAの解析（ライブラリー調整キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）（
fig.2）
- リードの品質の評価を行います。
- シーケンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）します。
- small RNA組成の分類を行います。
- サンプル間のリードカウントを補正するために正規化を行います。
- 階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6サンプル以上の場合）。
- ご指定の比較に沿って、変動するmiRNAおよびSmall RNA等を抽出します。
- miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
- 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
- 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。
解析内容は
統計解析（データ解析）のページをご参照ください。
納品物
miRNAの解析（ライブラリー調整キット：QIAseq miRNA Library kit）
・original_fastq（FASTQ生データ）
・サンプルQC結果（品質検査結果）
・データQC結果（FastQC、MultiQC）
・データ解析結果（正規化、変動miRNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析）
Small RNAの解析（ライブラリー調整キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）
・original_fastq（FASTQ生データ）
・Trimmed_fastq（トリミング済みFASTQ）
・Bam（アライメントデータ）
・サンプルQC結果（品質検査結果）
・データQC結果（FastQC、MultiQC）
・データ解析結果（正規化、変動miRNA抽出、変動Small RNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析）
＊ USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します。
サンプルについて
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RNA量 |
OD260
/280 |
RIN値 |
送付液量 |
| total RNA（microRNA含む） |
200ng
以上 |
1.5以上 |
8以上 |
10μL以上 |
血清・血漿・各種体液・培養上清・
エクソソーム由来RNA（miRNA含む） |
10ng
以上 |
ー |
ー |
10μL以上 |
RNA抽出する
血清または血漿 |
|
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400μL以上 |
| エクソソーム分画 |
ー |
ー |
ー |
1mL程度（＊1） |
エクソソーム分離後にRNA抽出をし、
miRNA-seqをする血清・血漿・培養上清 |
ー |
ー |
ー |
2mL以上
（孔径0.22μmフィルターでろ過必須） |
＊1 抽出後にRNAが10ng以上得られると想定される量をお送りください。
液量が1mLを超える場合は限外ろ過フィルターなどで濃縮し液量を調整してください。
・RNA抽出の際はカラムを使用し、有機溶媒が混入しないようにしてください。
・サンプル量が上記に満たない場合はお気軽にご相談ください。
・採血の際に使用する抗凝固剤はEDTAをお使いください。
ヘパリン使用の場合には、ヘパリナーゼ処理が必要になります。
・培養上清からエクソソームを分離して解析を行う場合、FBSにはウシ由来エクソソームが含まれているので
FBSフリーで培養することをおすすめします。
FBSフリーでの培養が困難な場合、ウシ胎児血清中のエクソソームを除去するキットのご利用をおすすめします。
・送付方法はサンプル送付方法をご確認ください。
