TaqMan® Probe法による遺伝子発現解析
- 網羅的な遺伝子発現解析の次は、遺伝子発現定量解析へ！
遺伝子発現解析・DNAマイクロアレイのデータ検証・RNAiの効果確認､SNP Genotyping・・・・
マイクロアレイのメーカーから、新たな発想と提案を形にした新サービスです。
例えば、数万の遺伝子の中から、ピックアップした遺伝子群。この先は、遺伝子発現差を定量することが重要になります。フィルジェンのマイクロアレイ受託サービスをご利用のお客様であれば、マイクロアレイと同一サンプルで、アレイに搭載されている配列を考慮して選定したTaqman® プローブで解析致します。
- 実績のあるApplied Biosystems (ABI) /ThermoFisher Scientific社製装置及び試薬を使用します。
高速かつ少量サンプルでの解析を可能にした「Applied Biosystems 7500 リアルタイムPCRシステム」を使用します。使用するプライマー＆プローブセットは、TaqMan® Gene Expression Assays（ABI社製）から選択します。完成されたプラットフォームで、より確かなデータ解析結果をご返却します。
<参考文献例>
・Hu J. et. al., Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer, Oncogene, 24, 1212 (2005).
・Xu R. H. et. al., Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain
undifferentiated proliferation of human ES cells, Nat. Meth., 17, 185 (2005).
- 特異性の高いTaqMan® ケミストリー法を使用します。
正確な遺伝子発現定量に最適なデザイン済みのプライマー＆プローブセット「TaqMan® Gene Expression Assays」を使用します。TaqMan®ケミストリー（fig.1）を利用し、遺伝子のExonを特異的に検出する遺伝子発現定量試薬です。
ヒト（19万種類以上）、マウス（17万種類以上）、ラット（15万種類以上）、シロイヌナズナ（9万種類以上）、ショウジョウバエ（4万種類以上）、線虫（9万種類以上）、アカゲザル（1万種類以上）、イヌ（5万種類以上）、ゼブラフィッシュ（4万種類以上）、ウシ（6万種類以上）に対応する幅広いラインナップから選択でき、スプライスバリアント解析やRNAi研究に優れた威力を発揮します。プライマー＆プローブセットのデザイン基となる遺伝子配列情報は、公共のデータベースやセレラのゲノムデータベースを利用しており、リアルタイムPCR定量に影響をあたえる可能性のあるリピートや偽遺伝子、SNPなどの影響を排除しています。上記セットにない遺伝子やその他の生物種については、ABI社の長年のアッセイ構築で培われたノウハウと経験を活用したアルゴリズムによるデザインパイプラインで、新たにプライマー＆プローブを設計・合成します。
［TaqMan® ケミストリーの概略］（fig.1）
Taqman® プローブは、5’端にレポーターの蛍光色素（Reporter；R）、リン酸化された3’端にレポーター色素が発する蛍光を吸収する消光物質（Quencher；Q）が結合している20から30塩基のオリゴヌクレオチドで、ターゲットに特異的にハイブリダイズする様設計します（①）。
この状態では、レポーター色素からの蛍光は検出されません。PCR反応が進行するに従い（②）、DNAポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性により、Taqmanプローブが分解され、消光物質から遊離したレポーター色素の蛍光が検出されるようになります（③④）。
レポーターからの蛍光は、ターゲット遺伝子の量に比例するので、遺伝子発現は、蛍光量の増加として定量できます。
この反応は、非常に特異性が高いので、プローブ中の1塩基が異なれば反応は進行せず、この性質を利用することでSNP解析なども行えます。
- SYBR GreenⅠによるインターカレーター法と、Taqmanプローブ法の比較（fig.2）
「SYBR GreenⅠ」は、二本鎖DNAに結合することで蛍光発光する試薬（インターカレーター）です。インターカレーターは、PCR反応によって合成された二本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発します。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターできます。ターゲットに特異的な蛍光標識プローブを設計・合成する必要がなく、簡便にさまざまなターゲットの測定に利用できます。その反面、「SYBR GreenⅠ」は二本鎖DNAに入り込むと蛍光が増幅される性質をもった蛍光色素で、二本鎖DNAをその配列に無関係に検出します。つまり、プライマーダイマーができたり、非特異的なPCR産物ができる様な状況になると、この様な副産物も含めたシグナルを示してしまいます。
Taqmanプローブを使うとプライマー設計が、「SYBR GreenⅠ」より簡便になり、仮に副産物ができてしまっても、プローブの配列特異性が副産物の影響を最小限に止めます。つまり、プライマーだけで配列を識別しなければならない「SYBR GreenⅠ」と異なり、TaqManプローブを使うとプライマーとTaqmanプローブの両方で配列を認識するので、その特異性が高くなります。
サンプルのリアルタイムPCRおよび定量解析
お客様のRNAサンプルより、リアルタイムRT-PCR反応を行い、ΔΔCt法による比較定量解析を行ったデータをお返しします。
ハウスキーピング遺伝子などのリファレンス遺伝子（内在性コントロール遺伝子）についても同様の作業を行い、得られた値でRNA量を補正し、ターゲット遺伝子の相対的発現量を求めます。
解析データをCD-Rに収録し、お客様へご送付致します。
［定量方法について］
リアルタイムPCRを使って、ある遺伝子のｍRNA発現量をサンプル同士で相対的に比較する場合、各サンプルRNAからRT-PCRによってターゲット遺伝子の増幅を行い、その立ち上がりサイクル数（Cycle Threshold：Ct値）を求めて比較します。比較を正確に行うためには、同じ細胞数のサンプルから同じ効率でRNAが抽出され、目的のRNAが同じ効率で増幅されていることが前提となります。しかし、実際にはその様な条件は満たされないので、リファレンス遺伝子の相対発現量をもとに、サンプル間のRNA量の補正を行います。（相対定量法）
本サービスでは、ハウスキーピング遺伝子やご指定の遺伝子をリファレンス遺伝子として、相対定量法による比較定量解析を行います。
