概要

遺伝子発現に大きく影響を与えることが知られているmiRNA、および生殖細胞におけるトランスポゾン抑制に関わるpiRNA、およびmiRNAを含むSmall RNAの発現量比較や標的遺伝子予測などを行う受託サービスです。
Small RNAは、non-coding RNA（ncRNA）の一種です。遺伝子発現に大きく影響を与えることが知られているmiRNA やスプライシングに関わるとされるsmall nuclear RNA （snRNA） などのSmall RNAを網羅的に解析します。

特長

各種試料に対応しています。微量試料の解析に力を入れており、特にエクソソーム由来Small RNAを用いた解析の実績が豊富です。

• 細胞・組織由来のtotal RNA
  
• 血清・血漿 由来total RNA
  
• 血中エクソソームRNA
  
• 血中cfRNA
  

解析対象に応じて下記のキットをご利用いただけます。

• miRNA-seq　(miRNA、piRNA) QIAseq miRNA Library Kit（Qiagen社）
  ＊分子バーコードUnique Molecular Indices（UMI）対応
  
• Small RNA-seq（miRNA、siRNA、piRNA、scRNA、snoRNA）SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech社）

解析の流れ

1. 試料のクオリティチェック（QC）を行います。
2. miRNAまたはSmall RNAを対象としたシークエンスライブラリーを調製します。
　＊ライブラリー調製試薬
　　QIAseq miRNA Library Kit（Qiagen社）
　　SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech社）
3. 調製したシークエンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シークエンサー（NextSeq 500、NovaSeq 6000、Hiseq Xなど）でシークエンスします。
4. シークエンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、発現量を定量化（正規化）し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルを作成します。デフォルトでは、TMMで定量化します。ご要望に応じて、Small RNAの分類、発現変動遺伝子抽出、時系列解析、ターゲット遺伝子予測などの解析を実施します。

データ解析

miRNAの解析（ ライブラリー調整キット：QIAseq miRNA Library Kit ）

1. リードの品質の評価を行います。
2. QIAGEN社クラウドサーバー（GeneGlobe Data Analysis Center）により、シークエンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、分子バーコード（UMIs）によるPCR重複の除去を行い、リードカウントをします。
3. small RNA組成の分類を行います。
4. 試料間のリードカウントを補正するために正規化（TMM等）を行います。
5. 階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6試料以上の場合）。
6. ご指定の比較に沿って，変動するmiRNA等を抽出します。
7. miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
8. 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
9. 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことができます。

＊ 解析内容は統計解析（データ解析）のページをご参照下さい。

Small RNAの解析（ ライブラリー調整キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）

1. リードの品質の評価を行います。
2. シークエンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）します。
3. small RNA組成の分類を行います。
4. 試料間のリードカウントを補正するために正規化（TMM等）を行います。
5. 階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6試料以上の場合）。
6. ご指定の比較に沿って、変動するmiRNAおよびSmall RNA等を抽出します。
7. miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
8. 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
9. 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。

＊ 解析内容は統計解析（データ解析）のページをご参照下さい。

---

納品物例

（fig.1）（fig.2）（fig.3）
miRNAの解析（ ライブラリー調整キット：QIAseq miRNA Library Kit ）

• original_fastq（FASTQ生データ）
• 試料QC結果（品質検査結果）
• データQC結果（FastQC，MultiQC）
• データ解析結果（正規化，変動miRNA抽出，標的遺伝子予測，GO解析，Pathway解析）

Small RNAの解析（ ライブラリー調整キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）

• original_fastq（FASTQ生データ）
• Trimmed_fastq（トリミング済みFASTQ）
• Bam（アライメントデータ）
• サンプルQC結果（品質検査結果）
• データQC結果（FastQC，MultiQC）
• データ解析結果（正規化、変動miRNA抽出、変動Small RNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析）

＊ USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します。

---

必要試料量について

	RNA量	濃度	OD260/280	RIN値	送付液量
total RNA （microRNA含む）	1μg以上	100ng/μL以上	1.5以上	8以上	10μL以上
濃縮Small RNA	500ng以上	50ng/μL以上	1.5以上	－	10μL以上
エクソソーム分画由来 total RNA（miRNA含む）	1ng程度 （＊1）	－	－	－	10μL以上
RNA抽出する血清または血漿	－	－	－	－	400μL以上
エクソソーム分画	（＊2）	－	－	－	（＊2）
エクソソーム分離後にRNA抽出をし miRNA-seqをする 血清・血漿・培養上清	－	－	－	－	細胞培養上清：15mL以上 血清・血漿：2mL以上

＊1 エクソソーム分画由来total RNAは1ngからシークエンスライブラリー調製が可能ですが、全量で10ngを下回る試料はクオリティチェックが実施できません。
　　ご注意下さい。
＊2 超遠心等で分画したエクソソーム分画の送付量については、あらかじめご相談下さい。

＊ RNA抽出の際はカラムを使用し、有機溶媒が混入しないようにして下さい。
＊ 試料量が上記に満たない場合でも解析は可能ですが、必ずあらかじめご相談下さい
＊ 採血の際に使用する抗凝固剤はEDTAをお使い下さい。ヘパリン使用の場合には、ヘパリナーゼ処理が必要になります。
＊ 培養上清からエクソソームを分離して解析を行う場合、FBSにはウシ由来エクソソームが含まれているのでFBSフリーで培養することをおすすめします。
　　FBSフリーでの培養が困難な場合、ウシ胎児血清中のエクソソームを除去するキットのご利用をおすすめします。
＊送付方法は「サンプル送付方法」をご確認下さい。