トランスジーンの挿入位置同定 ID: J00108

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遺伝子導入された細胞や動物の安全性評価や品質確認に

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サービスについて

特長

ロングリードシーケンサーを用いたゲノムワイドなシーケンスにより、トランスジーンの挿入位置および挿入パターンを解析
トランスジェニック動物やノックイン細胞の解析に最適
ショートリードシーケンサーを用いてより安価に挿入位置確認も可能

概要

ウイルスベクターを用いて製作されたiPS細胞の安全性評価、トランスジェニックマウスのトランスジーン挿入位置同定による品質確認、CHO細胞のトランスジーン挿入位置同定による生産性評価、モバイルエレメントの挿入位置同定による育種研究などに有効です。
ロングリードシーケンサーPacBio Sequel II（パシフィックバイオサイエンス社）を用いた解析により、挿入位置だけでなく繰り返し配列の多い複雑な挿入パターンや挿入配列を解析します。また、ショートリードシーケンサーNovaSeqシステム（イルミナ社）を用いた挿入位置のみの特定も可能です。

サービス内容

トランスジーンの挿入位置同定　ロングリード
30～50kb程度に断片化したゲノムDNAからライブラリーを調製し、ロングリードシーケンサーSequel IIを用いて全ゲノムシーケンスを行います。取得したデータは挿入配列へマッピングし、そのマッピングされたリードをホストゲノム配列＋挿入配列にマッピングします。次に、ホストゲノム配列および挿入配列にスプリットされたリードを抽出し、挿入位置特定および挿入位置周辺のコンセンサス配列作成を行います。挿入領域全長が20kb以下の場合は、全長配列取得、コピー数同定あるいは配列の挿入パターン評価が可能です。挿入領域長が20kbを超える場合は別途ご相談ください。（fig.1）

・ブレイクポイントの検出結果例（fig.2）
挿入領域の特定を行うため、挿入配列に対してマッピングを行い、挿入配列を含むリードの抽出を行います。抽出された「挿入領域にマップされたリード」を用いて「参照配列＋挿入配列」に対するマッピングを行い、ブレイクポイントを検出します。

・コンセンサス配列へのマッピング例（fig.3）
検出されたブレイクポイントごとに参照配列と挿入配列をまたぐ形でマップされたリードを分類し、ブレイクポイント付近のコンセンサス配列を構築後、挿入配列、およびブレイクポイントで分割したリファレンス配列をマッピングします。

fig.1 トランスジーンの挿入位置同定　ロングリード

fig.2 ブレイクポイントの検出結果例

fig.3 コンセンサス配列へのマッピング例

トランスジーンの挿入位置同定　ショートリード
300～600bp程度にランダムに断片化したゲノムDNAからライブラリーを調製し、イルミナ社次世代シーケンサーを用いて全ゲノムシーケンスを実施いたします。取得したデータは挿入配列と参照ゲノム配列へマッピングし、両方にマッピングされたリード情報（Discordant reads [d]）およびブレイクポイントをまたぐリード情報（Split reads [s]）から挿入位置を検出、挿入位置の情報を納品いたします。（fig.4）

・トランスジーン挿入図（fig.5）

fig.4 トランスジーンの挿入位置同定　ショートリード

fig.5 トランスジーン挿入図

・検出可能なトランスジーン挿入情報

ショートリードロングリード

ブレイクポイント検出〇〇

挿入配列構築、パターン特定 × 〇（＊1）

＊1 挿入領域長20 kbを超える場合は挿入位置付近の配列構築、パターン特定となります。

	ショートリード	ロングリード
ブレイクポイント検出	〇	〇
挿入配列構築、パターン特定	×	〇（＊1）

納品物

作業報告書
シーケンスデータ一式
マッピング結果
ブレイクポイントの検出結果
コンセンサス配列（ロングリードの場合のみ）

受入サンプル

参照ゲノム配列や挿入遺伝子配列および導⼊⽅法の情報
ゲノムDNA

極力ホモ個体より得られたサンプルをご用意ください。
以下の点にご注意の上、解析サンプルを調製してください。

	サンプル量	濃度	液量（目安）	純度
	サンプル量	濃度	液量（目安）	OD₂₆₀/OD₂₈₀	OD₂₆₀/OD₂₃₀
ロングリード	20μg以上	70ng/μL以上	100μL以上	1.6以上
ショートリード	4μg以上	80ng/μL以上	50μL以上	1.6以上

・DNAは滅菌水もしくはReduced EDTA TE buffer：10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA pH8.0に溶解してください。
・ロングリードでの解析の場合、DNA抽出は長鎖DNA抽出用キットを使用してください。
　抽出後は凍結せず冷蔵（4℃）で、できるだけ早くサンプルをご送付ください。上記基準に満たない場合は別途お問い合わせください。
・電気泳動（1％ゲル）にて10～20 kb以上に明確なバンドが検出され、低分⼦の混⼊および分解がないことをご確認ください。
・上記基準に満たない場合は別途お問い合わせください。

【サンプル送付容器について】
・ゲノムDNAサンプルは1.5mLチューブでご提供ください。0.2mL、0.5mL、8連チューブでのご提供はご遠慮ください。
＊ショートリードシーケンス　24検体以上の場合は96 well plateでご提供ください。プレートで送付いただけない場合は、納期が延びる場合がございます。

＜推奨プレートおよびシール＞
・Eppendorf twin.tec full-skirted 96-well PCR plates（Eppendorf社, No. EP-0030128.648）
・タイタースティックHCフィルム（WATSON社, No. 547-KTS-HC）

ご注文に関して

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参考価格・納期

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