ヒトiPS細胞およびがん細胞の遺伝子改変サービス ID: J01062

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ヒト由来の細胞から細胞初期化（iPS化）された細胞やがん細胞の特定遺伝子をCRISPR/Cas9を使用して遺伝子を破壊する受託サービスです。

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サービスについて

ヒト由来の細胞から細胞初期化（iPS化）された細胞やがん細胞の特定遺伝子をCRISPR/Cas9を使用して遺伝子を破壊する受託サービスです。単一遺伝子および複数遺伝子の同時破壊も可能です。（fig.1）

受託例

単一遺伝子DNMT3Aに対するガイドRNAを作製し細胞に導入後にシーケンス確認を行った。

ホモ変異株の取得
　A25株　DNMT3Aシークエンス結果
　PCRプロダクトをダイレクトシークエンス解析

使用したiPS細胞株特殊免疫研究所にて樹立したiPS細胞株（Epi5により初期化されたPBMC由来細胞）（fig.2）
遺伝子改変技術：CRISPR/Casシステム利用
遺伝子導入法エレクトロポレーション（4D-Nucleofetor）
選抜方法：Puromycin選抜
gRNAデザイン：gcatgatgcgcggcccaagg agg （ex20をターゲット）
　　　　　　　　　　　　target　　　　PAM

＊参考資料 Liao,Jing, et al. Nature genetics 47. 5（2015） : 469-478

複数遺伝子破壊

DNMT3AおよびDNMT3Bをターゲットに両遺伝子に対するガイドRNAを設計し同時にトランスフェクションした。

作業結果
ピックアップ数 11クローン
DNMT3Aのみ変異 3クローン＆DNMT3Bのみ変異 2クローン
DNMT3A、3Bともに変異 3クローン　ダブルノックアウトホモ1クローン確認

使用したiPS細胞株特殊免疫研究所にて樹立したiPS細胞株（Epi5により初期化されたPBMC由来細胞）（fig.3）
遺伝子改変技術：CRISPR/Casシステム利用
遺伝子導入法エレクトロポレーション（4D-Nucleofetor）
選抜方法：Puromycin選抜
DNMT3A gRNAデザイン：gcatgatgcgcggcccaagg agg （ex20をターゲット）
　　　　　　　　　　　　　　　　target　　　　PAM
DNMT3B gRNAデザイン：gaatgataaactcgagctgc agg （ex21をターゲット）
　　　　　　　　　　　　　　　　target　　　　PAM

＊参考資料 Liao,Jing, et al. Nature genetics 47. 5（2015） : 469-478

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工程	作業内容	1件あたりの費用（税抜）
工程1	遺伝子導入　株化細胞をご提供いただきます（融解、培養、増殖、継代）　特殊免疫研究所への細胞導入のための微生物検査　遺伝子導入 Cas9 gRNA発現プラスミド　（通常2つの条件で遺伝子導入を実施）　播種、細胞培養	￥400,000
工程2	細胞セレクション　プラスミド導入後、限外希釈によるサブクローン化作業　培養、増殖、継代　100クローンを目標に作業を行います。	￥800,000
工程3	解析（ゲノム抽出から遺伝子解析まで）　取得した全クローンからゲノム抽出します　抽出したゲノムDNAを用いてsurveyor assay（またはPCRスクリーニング）による遺伝子変異の確認　遺伝子変異を確認できた株のシークエンス解析を行います。	￥400,000
工程4	エキスバンド作業ー凍結保存　選抜されたクローンを培養、継代による細胞の増殖を行います。　細胞の増殖作業を終えた後、バイアル作製　1バイアルあたり、5×10⁶～1×10⁷ cell/mL	￥50,000
ヒトiPS細胞のノックアウト細胞の樹立の場合は￥2,470,000（税抜）となります。		￥1,650,000

［注意事項］
限界希釈法による細胞株取得作業が困難と判断した場合、ご依頼者様と協議の上、細胞株の純化作業を進めます。（薬剤耐性遺伝子の使用の有無等）
工程3にて目的の細胞株が得られていないと確認された場合、ご依頼者様との協議の上、作業を再度実施いたします。